5.3. Молекулярни методи за откриване и количествено определяне на ГММ

5.3.1. Откриване на ГММ

Първите Генетично Модифицирани Организми (ГМO) с приложение за целите на здравеопазването и промишлеността са модифицирани щамове Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae, произвеждащи инсулин. В последствие се прилагат множество рекомбинантни микроорганизми. Всички те се използват в индустриални биореактори при строго дефинирани условия и такива процеси обикновено не изискват провеждане на тестове за откриване на ГМО.

Необходимостта от такива специфични тестове се появява с внедряването през средата на деветдесетте години на миналия век на генетично модифицирани (ГМ) животни и растения в околната среда.

Главно ГМ зърнени храни провокираха започването на важни дебати, особено в Западна Европа, за оценка на безопасността на храните и за потенциално модифициране на околната среда. За успокоение на потребителите се появиха храни, обозначени като свободни от ГМО. Обаче, не само суровините могат да се използват за изготвяне на храни, но също така и множество съставки от растителен произход, които могат да присъстват в много ниски количества в крайния продукт. Такъв е например случая с лецитин, екстрахиран от соя. Лецитинът се използва като добавка в много индустриални производства на шоколад или ароматизирани с шоколад продукти. Това, което трябва да се анализира всъщност не е пречистеният лецитин (който е идентичен с лецитина от немодифицираните соеви растения), а само някои модифицирани ДНК последователности или кодираните от тях рекомбинантни белтъци. Последните могат да присъстват само като следи, което налага необходимост от много чувствителни методи за тяхното откриване.

5.3.2. Методи за откриване

Откриването на ГМO или техни производни може да се осъществи чрез детекция на молекулата – първична мишена (самата ДНК последователност и евентуално - РНК), специфично свързана с генетичната модификация на своя продукт (рекомбинантният белтък, който може да се продуцира в съответствие с генетичната промяна). По-голяма част от наличните методи се отнасят до откриване на ДНК и само няколко техники се прилагат в детекцията на РНК и белтък. Причините за този факт са следните:

• ДНК може да се амплифицира и пречисти бързо и ефективно с помощта на ПВР. Мултиплицирането на РНК и белтъци е по-сложно и изисква повече време.
• ДНК е стабилна молекула, докато РНК е нестабилна. Белтъкът лесно може да стане обект на температурна денатурация по време на преработването на храните, т.е. неговата стабилност зависи от множество външни фактори.
• Ако модифициращият елемент е ядрена ДНК, съществува линейна зависимост между нейното количество и това на ГМO. Такава корелация обаче, не е открита между количеството ГМO и РНК/белтък.
• Тъй като генетичната модификация е извършена на ниво ДНК, логично е откриването на тази модификация да се осъществява на същото ниво.

Понастоящем всички търговски ГМO притежават чуждеродна ядрена ДНК.

5.3.3. Методи, основани на белтък

Основата на тези методи е имунологична и се свежда до специфично свързване от типа “антиген-антитяло” и класически анализ ELISA. Реакцията антиген – антитяло разпознава чуждеродната молекула, свързва се с нея и така полученият комплекс се открива обикновено с хромогенна реакция. Тъй като антитялото, необходимо за откриване на антигена, не би могло да се разработи без достъп до самото пречистено такова, то то трябва да се синтезира изкуствено по известна аминокиселинна последователност или да се пречисти от изследваните ГМO.

Обикновено трансгенният продукт е малък полипептид или белтък, който може да се експресира под контрола на силен конституитивен промотор във всяка тъкан и на практика по всяка време от жизнения цикъл на растението. Следователно, белтъкът е в достатъчно количество и представлява аналитична мишена. Трябва да се има предвид обаче, че напоследък в модифицираните растения желаният белтък се синтезира само под контрол на индуцируем промотор (т.е. при стресови условия, по време на определен етап от жизнения цикъл и т.н.). В тази ситуация откриването и анализът за наличие на рекомбинантен белтък често са неадекватни.

5.3.4. Методи, основани на РНК

При тези методи се провежда специфично свързване между РНК молекулата и праймер (синтетичен РНК или ДНК олигонуклеотид). Праймерът, комплементарен на началото на РНК молекулата, се свързва с нея и в резултат се получава двойноверижен хетеродуплекс, подобен на ДНК. Използвайки обратна транскриптаза се провежда de novo биосинтеза на ДНК, която след това може да се амплифицира с ПВР и да се открие. Недостатък на този метод е фактът, че специфичните праймери не могат да се конструират без познания за състава на РНК, която трябва да се открие.

5.3.5. Методи, основани на ДНК – амплифициране с ПВР

Методите, основани на ДНК, разчитат на мултипликация на специфична част от молекулата на ДНК чрез техниката на ПВР. За визуализиране на амплификационните продукти рутинно се използва гел електрофореза. Тя може да се проведе самостоятелно или да се свърже с ендонуклеазно смилане (ПДРФ-ПВР). Един по-сложен вариант на основния ПВР протокол включва определяне на Tm профила чрез средствата на внедряване на багрила в двойната верига на ДНК и излъчване на флуоресцентна светлина. С увеличаване на температурата двете вериги на ДНК започват да се разделят и съответно излъчената светлина, която може да се измери, намалява. Tm е много по-специфична характеристика на ДНК последователностите в сравнение с дължината на ДНК. Друг вариант е използването на сонди и провеждане на хибридизация с ДНК или РНК. Ако се конструира подходяща сонда, то тя може да отдиференцира природните от чуждеродните последователности. Бележейки сондата с радиоактивни или нерадиоактивни съединения може да се улесни детекцията на молекулите. Понастоящем, най-често използваните техники за анализ на ГМО са гел електрофорезата и хибридизацията.

Скринингът на хранителни проби за наличие на ГМO с използване на основния протокол на ПВР включва следните процедури:

• Екстракция на ДНК от пробата и стандарти с неизвестно количество ГМO;
• Провеждане на няколко ПВР със специфични праймери (обикновено за добре известни регулаторни последователности, каквито са например промоторите 35SCaMV или Tnos);
• Визуализиране на ДНК фрагментите в агарозна гел електрофореза;
• Анализ и полу-количествена оценка с помощта на софтуер за изображения.

С помощта на методите на основата на множествена ПВР могат да се скринират и откриват няколко ДНК последователности в рамките на една-единствена реакция. Обаче, разработването на множествен анализ изисква внимателно тестване и потвърждаване. Наличните амплификационни фрагменти трябва да бъдат допълнително анализирани за разграничаване на отделните ампликони. Това може да се осъществи с помощта на специфични хибридизационни сонди в гел електрофореза, като се сравнят фрагментите по размер, или с използване на белязани праймери.

Голямо преимущество на тази техника е фактът, че са необходими по-малък брой реакции за изследване на пробата за наличие на ДНК, произхождаща от ГМO. Ако е необходимо провеждането на допълнителни количествени анализи би било добре да се знае количеството на кои ГМO ще се следи, тъй като процедурата е относително скъпа. Идентификацията на определен ГМО е важна също така и в контекста на нашите познания за одобрените и не-одобрени ГМO.

Друг подход е количественото определяне, на базата на ПВР, което може да бъде осъществено както по време на амплификационния процес (т.нар. ПВР в реално време), така и след приключване на реакцията (ПВР в крайна точка).

Анализите на крайния продукт често се основават на сравнение на количеството на амплифицираната ДНК от две ДНК мишени: едната е тази, чието количество трябва да се определи, а другата е т.нар ‘конкурент’ (в малко, но известно количество), която се добавя в амплификационната смес преди провеждането на реакцията и коамплифицира с мишената, чието количество ще се определя. Този процес се нарича още конкурентна количествена ПВР. Той се основава на презумпцията, че ако и двете ДНК – мишената и конкурента – дадат едно и също количество амплификационен продукт, то и началното количество на тези ДНК молекули се приема за едно и също.

При ПВР анализа в реално време количеството на синтезирания продукт по време на ПВР се определя директно чрез измерване на флуоресценцията. Има търговско достъпни хибридизационни сонди, излъчващи флуоресценция, съответстваща на количеството на синтезираната ДНК. Количеството на синтезирания продукт може да се определи и чрез излъчването на внедрено флуоресцентно багрило, но при този случай не е възможно да се направи разлика между специфичните и неспецифични продукти. Предимство на този метод е, че може да се следи количеството на образуваните продукти в динамика, а също така и да се определи броя на циклите, необходими за получаване на определено количество ПВР продукти.

ПВР в реално време изисква по-сложно и скъпо оборудване, но е по-бърз и по-специфичен метод от конкурентната ПВР.

5.3.6. Процесът на детекция

Процесът на детекция представлява процедура, състояща се от следните индивидуални стъпки:

1. Вземане на проба. Стратегията за вземане на проба включва комплексна статистика за получаване на надеждна оценка на количеството ГМО или техни производни.

2. Хомогенизиране. Тази стъпка включва хомогенизиране на пробата.

3. Изолиране/пречистване. Тази стъпка касае изолиране и пречистване на ДНК, РНК или белтък. Най-критичните фактори за тази стъпка са количеството (концентрацията), чистотата и качеството на изследваната макромолекула. Тук отново се използва статистически анализ.

4. Анализ за присъствие/отсъствие. На този етап се провежда анализ за присъствие или не на ГМO или техни производни. Както беше споменато по-горе разполага се с широк набор от методи, всеки един от които предлага различна разделителна способност за отличаване на производните на различните ГМO и различна надеждност по отношение на фалшиви (+) и (-) резултати. Други параметри, които трябва да се имат предвид при избора на метод за детекция са: възможността молекулата, която трябва да бъде открита, да бъде напълно деградирала, т.е. да не може да бъде определена; възможността по време на преработката на храните, молекулата, която бе трябвало да е обект на избрания метод за детекция, да бъде отстранена; възможността анализът да се провежда със смес от ГМO и това да доведе до сложен и време консумиращ идентификационен процес.

5. Идентификация. За идентификация на целевата молекула обикновено трябва да се потвърдят всички (+) резултати с цел да се елиминират фалшивите (+) реакции и да се потвърди идентичността на намерената молекула.

6. Количествено определяне. На този етап се провежда количествено определяне на модифицирания материал в дадена проба. Тук отново статистическият подход е важен, тъй като количествените определяния винаги изискват стандарти.

7. Интерпретация на резултатите от анализа.

5.3.7. Предимства и недостатъци на методите за детекция

Границите на детекция и количествено определяне могат да се категоризират в три групи:

1. Абсолютни граници – най-малкия брой копия, които трябва да присъстват в началото на първия цикъл за получаване на коректно определяне с вероятност 95 %;

2. Относителни граници – най-ниският относителен процент от генетично модифициран материал, който може да се определи;

3. Практически граници – границите, приложими за определена проба.

Специфичността на наличните понастоящем методи, основани на ДНК, може да се категоризира в четири групи:

1. Скрининг методи, които откриват широк обхват от ГМO без да ги идентифицират;

2. Скрининг методи за определен тип генетична модификация;

3. Методи, специфични за даден конструкт, използвани понякога за идентификация на ГМO;

4. Методи, основани на специфична трансформация, използвани за идентификация на ГМO (все още на етап лабораторна разработка, не се предлагат за търговски цели).