5.1. Техники за генетична модификация на микроорганизми

5.1.1. Класически методи

Класическите методи за геномна модификация на микроорганизмите се разделят на два типа:

• Селекция на мутации, възникнали спонтанно и индуцирани от различни физични и химични фактори на средата. Спонтанните мутации са последица от пренареждането на наследствената ДНК молекула поради заместване на един нуклеотид с друг, добавянето или делецията на един или повече нуклеотиди или други типове реформации. Голям брой от спонтанните мутанти възникват поради движението на транспозонни елементи към нови места в двойно-верижната ДНК. Такива елементи са типични за растения, животни и микроби.
• Обмен на ДНК между близкородствени организми. Този тип на генна модификация при микроорганизмите се състои във въвеждането на нова генетична информация чрез хромозомна или плазмидна ДНК. Това събитие настъпва, когато ДНК от хромозомата на донорния микроорганизъм се интегрира в ДНК на реципиентния. Тъй като са само-реплициращи се, плазмидите пренасят ДНК от донора в реципиента без интегриране в хромозомалната ДНК. По този начин, плазмидната ДНК може да бъде пренесена към доста различаващи се организми, в сравнение с донора. Движението на плазмида може лесно да бъде проследено поради маркера, който се съдържа в неговата молекула (напр. антибиотична резистентност). Три различни класически типа на генен трансфер са характерни за бактериите. Счита се, че те протичат в природата: 
  • ДНК-свързана трансформация (ДНК се пренася като “гола” ДНК)
  • Трансдукция – преносът на ДНК се осъществява чрез вирус
  • Конюгация – ДНК се пренася по време на клетъчен контакт между донорните и реципиентните клетки.

5.1.2. Молекулярни техники

Съвременният молекулярно-технологичен напредък в методите за мутагенеза и пренос на гени, значително увеличава диапазона от микроорганизми,   които са обект на  ДНК пренос от неблизко-родствени организми. Бариерата на рода и царството вече не е непреодолимо обстоятелство.

Модерните методи, използвани при бактериите позволяват интегрирането на рекомбинантния конструкт в специфични места на хромозомата или плазмидите. Все пак, процедурите за генна модификация трябва да се оценяват по отношение на тяхната сигурност. По тази причина предмет на дискусия са следнитеособености: характеристиките на микроорганизма-гостоприемник по отношение на включения(те) ген(и); особености на вектора и конструкта; методите за ДНК пренос.

Когато бактериите се използват като микроорганизми-гостоприемници, процедурата за оценка на риска изисква  наличие на данни за  безопасна консумация на този микроорганизъм като храна или като хранителен компонент. Ако това изискване не е изпълнено, безопасността на гостоприемника трябва да се изследва и установи. При гостоприемник – еукариотна клетка се прилагат същите съображения. Внесеният(те) ген(и) може да бъде получен от същия микробилаен вид или от еволюционно по-далечен организъм. Инсерционният генен продукт трябва да има история на безопасна употреба в храните или неговата сигурност трябва да се докаже. Колкото по-къс е вмъкнатият ДНК фрагмент, толкова по-намалена/улеснена ще бъде процедурата за оценка на хранителната безопасност.

По отношение на характеристиките на вектора и конструкта – ако векторът се използва като част от генома на ГММ, цялата ДНК секвенция трябва да бъде охарактеризирана, включително репликони, промотори, селективни маркери, линкери, както и всяка друга част на ДНК. Векторът трябва да съдържа нуклеотидна последователност от микроорганизми с история на безопасна употреба в храните. Селективните маркери трябва да се изберат много строго и въз основа на безопасната употреба, като маркерите за антибиотикова резистентност трябва да се избягват. Ако все пак те се ползват, трябва да се приложат специфични методи за отделянето им от генома на ГММ (напр. секвенционно специфична рекомбинация). При еукариотите са създадени специфични клониращи вектори, като центромерни плазмиди, дрождеви изкуствени хромозоми, плазмиди, базирани на ‘килър’ фактори и др.

Когато говорим за ДНК пренос има изискване за използването на методи от физична, химична и биологична природа, които да минимизират големи генетични пренареждания в генома на гостоприемника. При използването на интегративни вектори, нуклеотидната последователност на фланкиращите региони на интегративното място в хромозомата трябва да бъде характеризирана. Тази информация е необходима за предвиждането на риска от използваните методи. При еукариотите, има сигурни методи за директно интегриране на in vitro модифицирани или създадени генни конструкти в специфични хромозомни места и за делецията на гени, използвани при някой видове. Въз основа на тези методи, са създадени трансгенни конструкти, които са много стабилни по време на вегетативното размножаване на клетките. Съществува и възможност за рекомбинация чрез мейтинг с близки щамове на собствената микрофлора. Когато генетичните особености на използвания щам не са добре познати, недостатъчната информация за възможните рекомбинантни събития прави невъзможно предсказването на механизма и интеграционното място на чуждите гени. По този начин, е възможно методологията, използвана за генетична манипулация на дрожди и филаментозни гъби да позволи интегрирането в променливи места, които да предизвикат появата на различни биотехнологични свойства и генетична  нестабилност на ГММ. 

5.1.3. Сравнение между класическите и молекулярните подходи

Термините “класически” и “молекулярни”, по отношение на методологията за генетична модификация на микроорганизми, както вече беше споменато, означават увеличение на тяхната генетична вариабилност. Този ефект се постига чрез използването на класически методи за спонтанно или мутагенно индуцирани вариации, чрез хибридизация или генен трансфер. Тези методи са неточни, непреки и по-малко мощни, в сравнение с молекулярните. Все пак няма съмнение, че не съществува концептуална разлика между генетичната модификация на микроорганизмите чрез класически или молекулярни техники, използвани за ДНК модифициране и генен трасфер.

Фиг. 1 показва генетичната модификация на микроорганизмите и пътя за въвеждане в околната среда. Тук, двата метода са унифицирани, тъй като няма значение дали класически или молекулярни техники са използвани в етапите на оценка в лабораторията, полето или при широко-мащабното въвеждане в околната среда. 

Фигура 1:

Съответните биологични принципи, които характеризират тази концепция са включени в докладите на EFSA:

• Основният фокус при вземането на решение за въвеждане в околната среда е продуктът, получен чрез генна модификация и селекция, а не самия процес.
• Характеризирането на продукта изисква информация за използвания процес, но природата на процеса не е достатъчен критерий за решението дали съответния продукт ще бъде повече или по-малко проследен.
• Реакцията на микроорганизмите, модифицирани чрез молекулни или класически методи се основават на едни и същи физични и биологични закони. Натрупаните знания за продуктите на класическите модификации могат да бъдат използвани при оценка на продуктите, получени чрез молекулните техники по отношение на относителната безопасност и оценката на риска.