5.3.5. DNA-basierte Methoden - PCR-Anwendung

DNA-basierte Methoden können primär auf der Vervielfachung eines spezifischen DNA-Stücks mittels der PCR-Technik. Zur Sichtbarmachung der Amplifikationsprodukte wird routinemäßig die Gelelektrophorese eingesetzt. Diese kann allein oder mit Koppelung an einer Restriktionsendonuklease (RFLP-PCR) durchgeführt werden. Eine kompliziertere Variante des grundlegenden PCR-Protokolls beinhaltet die Bestimmung der Tm-Profils mittels eines Farbstoffes aus doppelsträngiger DANN, wodurch Fluoreszenzlicht emittiert wird. Mit Erhöhung der Temperatur beginnen die beiden Stränge der DNA sich zu trennen – und die Lichtemission, die gemessen werden kann, nimmt ab. Tm ist ein spezifisches Merkmal einer DNA-Sequenz, anders als im Falle der DNA-Länge. Schließlich kann man als Alternative hierzu auch Sonden verwenden und eine Hybridisierung mit DNA oder RNA durchführen. Wenn entsprechend konstruiert, vermag eine Sonde zwischen der nativen und der fremden Sequenz zu unterscheiden. Die Markierung der Sonde mit radioaktiven oder nicht-radioaktiven Verbindungen erleichtert die Identifikation des vorliegenden Moleküls. Für die GVO-Analyse werden die Gelelektrophorese und Hybridisierungstechniken derzeit die am häufigsten genutzt.

Ein Screening von Lebensmittelproben auf das Vorhandensein von GVO umfasst die Verwendung von basischen PCR-Protokollen aufgrund folgender Verfahren:

• Extraktion von DNA aus der Probe und Untersuchung auf den unbekannten GVO-Gehalt;

• Montage mehrerer PCR mit spezifischen Primern (in der Regel für bekannte regulatorische Sequenzen, wie die viralen 35SCaMV oder Tnos Promotoren);

• Sichtbarmachung der DNA-Fragmente mit Hilfe einer Agarose-Gelelektrophorese;

• Analyse und semi-quantitative Assay mit Hilfe einer Bildanalyse-Software.

Mit Multiplex-PCR-basierten Verfahren können mehrere DNA-Sequenzen in einem einzigen Reaktionsschritt detektiert und gescreent werden. Allerdings erfordert die Entwicklung eines Multiplex-Assays eine sorgfältige Prüfung und Genehmigung. Der Pool von Amplifikationsfragmenten muss außerdem zwischen den verschiedenen Amplicons unterscheiden können, damit sie analysiert werden können. Dies kann mit Hilfe spezifischer Hybridisierungssonden mittels Gelelektrophorese und über einen Vergleich der Größe der Fragmente oder mit speziell markierten Primern durchgeführt werden.

Ein großer Vorteil dieser Technik ist die Tatsache, dass weniger Reaktionen nötig sind, um eine Probe auf die Anwesenheit von GMO-abgeleiteter DNA zu testen. Falls es notwendig ist, weitere Quantifizierungstests durchführen, dann wird es gut sein, wenn man weiß, welche GVO zu quantifizieren sind, da das Verfahren relativ teuer ist. Die Identifizierung eines bestimmten GVO ist wichtig, gerade auch im Rahmen unseres Wissens über die zugelassenen und nicht zugelassenen GVO.

Ein weiterer Ansatz besteht darin, PCR-basierte Quantifizierungsmethoden anzuwenden. Die PCR-basierte Quantifizierung kann sowohl während des Amplifikationsvorgangs (der Echtzeit-PCR) als auch an seinem Ende (end-point PCR) durchgeführt werden.

Der Analyse des Endprodukts liegt zwei Strategien zu Grunde: bei der einen wird ein Kompetitor (in geringer Menge) hinzufügt, um das Gemisch vor der PCR zu verstärken mit dem Ziel einer Quantifizierung. Dieser Prozess wird auch als „competitive quantitative PCR“ bezeichnet. Er basiert auf der Annahme, dass, wenn beide Ziel-DNAs und die competitive DNA die gleiche Menge an Amplifikationsprodukten ergeben, die Ausgangsmenge an DNA auch die gleiche sein dürfte.

Bei der Echtzeit-PCR-Analyse wird die Menge eines Produkts, die während der PCR synthetisiert wurde, direkt durch Messung der Fluoreszenz in einer PCR abgeschätzt. Es gibt im Handel erhältliche Hybridisierungssonden, bei denen die emittierte Fluoreszenz mit der Menge der synthetisierten DNA korreliert. Die Menge des synthetisierten Produkts kann auch durch das Ausstrahlen von interkaliertem Fluoreszenzfarbstoff geschätzt werden, aber hier ist es nicht möglich, zwischen den spezifischen und nicht-spezifischen Produkten zu unterscheiden. Der Vorteil dieses Verfahrens ist, dass nicht nur die Menge des gebildeten Produkts, sondern auch die definierte Anzahl von Zyklen im Ablauf verfolgt werden kann, die benötigt werden, um eine bestimmte Menge an PCR Produkt zu erzeugen. Die Echtzeit-PCR erfordert eine kompliziertere und teure Ausrüstung; sie ist jedoch schneller und spezifischer als die kompetitive PCR.