5.3 Molekulare Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von GVM

5.3.1. GMM-Erkennung

Die ersten gentechnisch veränderten Organismen (GVO), die für medizinische oder industrielle Zwecke modifiziert wurden, verwenden Stämme von Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae zur Produktion von Insulin (1981). Seit dieser Zeit wurden weitere zahlreiche rekombinante Mikroorganismen erzeugt. Sie werden in industriellen Bioreaktoren eingeschlossen und erfordern im Allgemeinen nicht eine GVO-Erkennungs-Technologie.

Im Ergebnis führte dies Mitte der neunziger Jahre zur Freisetzung von gentechnisch veränderten (GV) Pflanzen und Tieren in die natürliche Umwelt.

GV-Pflanzen habe eine wichtige Debatte ausgelöst, vor allem in Westeuropa, über die Sicherheitsbewertung von Lebensmitteln und in Hinsicht auf eine mögliche Veränderung der Umwelt. Lebensmittel, die frei von GVO sind, wurden propagiert, um die Verbraucher zu beruhigen. Doch nicht nur Rohstoffe können zur Zubereitung von Speisen verwendet werden, sondern auch zahlreiche Zutaten pflanzlichen Ursprungs, die in geringen Mengen im Endprodukt vorhanden sein können. Dies ist beispielsweise der Fall bei aus Sojabohnen extrahiertem Lecithin. Lecithin wird als Zusatzstoff in einer Menge von Industrie-Rezepturen für aromatisierte Schokolade verwendet. Es ging dabei nicht um das Lecithin selbst, sondern einige modifizierte DNA-Sequenzen oder die von ihnen kodierten rekombinanten Proteine (deren Lecithin mit dem Lecithin aus den GM-freien Sojabohnen identisch ist). Letztere können nur in Spuren vorhanden sein, so dass sehr empfindliche Verfahren für deren Nachweis notwendig sind.

5.3.2. Typen von Detektionsverfahren

Der Nachweis von solchen DNA-Sequenzen und damit einer genetischen Veränderung der genetischen Veränderung – Primärziel der Analyse ist hier, mittels bestimmter Moleküle das rekombinante Protein der GMO oder deren Derivate zu erfassen. Der größere Teil der verfügbaren Methoden betrifft den DNA-Nachweis, während nur relativ wenige Techniken werden zur RNA- und Proteindetektion angewandt werden. Die Gründe hierfür sind:

• DNA kann schnell und effizient amplifiziert und gereinigt werden durch die Verwendung von PCR. Hingegen ist die Vermehrung von RNA und Proteinen komplizierter und ein zeitraubender Prozess.

• DNA ist ein stabiles Molekül, während RNA überhaupt nicht stabil ist. Das Protein wird durch Erhitzen während der Nahrungsmittelverarbeitung einer Denaturierung unterworfen, denn die Stabilität hängt von verschiedenen äußeren Faktoren ab.

• Falls das modifizierende Element die Kern-DNA ist, besteht eine lineare Abhängigkeit zwischen seiner Menge und der Menge an GMO. Doch eine solche Korrelation ist praktisch noch niemals zwischen der Menge des GVO und der der RNA / des Proteins beobachtet worden.

• Da die genetische Veränderung auf DNA-Ebene erfolgt, ist es sinnvoll, diesen Wechsel auf dem gleichen Niveau zu erkennen.

Heute enthalten alle kommerzialisierten GVO fremde Kern-DNA.

5.3.3. Proteinbasierte Verfahren

Grundlage dieser Verfahren ist immunologischer Art und gründet in der spezifischen Bindung vom Typ „Antigen – Antikörper“ und klassischer ELISA-Assays. Die Antigen-Antikörper-Reaktion erkennt das Fremdmolekül, indem sie sich an dieses so bindet, dass der gebundene Komplex in der Regel durch eine Farbreaktion nachgewiesen werden kann. Da der Antikörper, der benötigt wird, um das Antigen zu erkennen, nicht ohne Zugriff auf den gereinigten Antikörper selbst entwickelt werden kann, kann letzterer entweder künstlich in synthetisiert werden, sofern die Aminosäuresequenz bekannt ist, oder in gereinigter Form am GMO selbst studiert werden.

Im Allgemeinen ist das Produkt eines Transgens ein kleines Polypeptid oder ein Protein, das unter einem starken konstitutiven Promotor in jedem Gewebe und praktisch jeder Zeit im Lebenszyklus der Pflanze exprimiert werden kann. Auf eine solche Weise ist das Protein in genügender Quantität vorhanden. Jedoch wird in neueren GM-Pflanzen das gewünschte Protein nur unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors (beispielsweise unter Stressbedingungen, während des definierten Zeitlebenszyklus etc.) gebildet. In dieser Situation ist die Identifikation und Analyse der Anwesenheit des rekombinanten Proteins oft nicht ausreichend möglich.

5.3.4. RNA-basierte Methoden

Bei diesen Verfahren wird eine spezifische Bindung zwischen dem RNA-Molekül und einem Primer (RNA oder DNA synthetisches Oligonukleotid) herbeigeführt. Der Primer, ein Komplement am Anfang des RNA-Moleküls, verbindet sich mit ihm zu einem Doppelstrang, einem Heteroduplex, ähnlich wie bei der DNA. Unter Verwendung von reverser Transkriptase wird ein DNA-Molekül de novo synthetisiert, das weiterhin durch PCR amplifiziert und detektiert werden kann. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist der Umstand, dass die spezifischen Primer nicht ohne Kenntnis über die RNA-Zusammensetzung nachgewiesen werden können.

5.3.5. DNA-basierte Methoden - PCR-Anwendung

DNA-basierte Methoden können primär auf der Vervielfachung eines spezifischen DNA-Stücks mittels der PCR-Technik. Zur Sichtbarmachung der Amplifikationsprodukte wird routinemäßig die Gelelektrophorese eingesetzt. Diese kann allein oder mit Koppelung an einer Restriktionsendonuklease (RFLP-PCR) durchgeführt werden. Eine kompliziertere Variante des grundlegenden PCR-Protokolls beinhaltet die Bestimmung der Tm-Profils mittels eines Farbstoffes aus doppelsträngiger DANN, wodurch Fluoreszenzlicht emittiert wird. Mit Erhöhung der Temperatur beginnen die beiden Stränge der DNA sich zu trennen – und die Lichtemission, die gemessen werden kann, nimmt ab. Tm ist ein spezifisches Merkmal einer DNA-Sequenz, anders als im Falle der DNA-Länge. Schließlich kann man als Alternative hierzu auch Sonden verwenden und eine Hybridisierung mit DNA oder RNA durchführen. Wenn entsprechend konstruiert, vermag eine Sonde zwischen der nativen und der fremden Sequenz zu unterscheiden. Die Markierung der Sonde mit radioaktiven oder nicht-radioaktiven Verbindungen erleichtert die Identifikation des vorliegenden Moleküls. Für die GVO-Analyse werden die Gelelektrophorese und Hybridisierungstechniken derzeit die am häufigsten genutzt.

Ein Screening von Lebensmittelproben auf das Vorhandensein von GVO umfasst die Verwendung von basischen PCR-Protokollen aufgrund folgender Verfahren:

• Extraktion von DNA aus der Probe und Untersuchung auf den unbekannten GVO-Gehalt;

• Montage mehrerer PCR mit spezifischen Primern (in der Regel für bekannte regulatorische Sequenzen, wie die viralen 35SCaMV oder Tnos Promotoren);

• Sichtbarmachung der DNA-Fragmente mit Hilfe einer Agarose-Gelelektrophorese;

• Analyse und semi-quantitative Assay mit Hilfe einer Bildanalyse-Software.

Mit Multiplex-PCR-basierten Verfahren können mehrere DNA-Sequenzen in einem einzigen Reaktionsschritt detektiert und gescreent werden. Allerdings erfordert die Entwicklung eines Multiplex-Assays eine sorgfältige Prüfung und Genehmigung. Der Pool von Amplifikationsfragmenten muss außerdem zwischen den verschiedenen Amplicons unterscheiden können, damit sie analysiert werden können. Dies kann mit Hilfe spezifischer Hybridisierungssonden mittels Gelelektrophorese und über einen Vergleich der Größe der Fragmente oder mit speziell markierten Primern durchgeführt werden.

Ein großer Vorteil dieser Technik ist die Tatsache, dass weniger Reaktionen nötig sind, um eine Probe auf die Anwesenheit von GMO-abgeleiteter DNA zu testen. Falls es notwendig ist, weitere Quantifizierungstests durchführen, dann wird es gut sein, wenn man weiß, welche GVO zu quantifizieren sind, da das Verfahren relativ teuer ist. Die Identifizierung eines bestimmten GVO ist wichtig, gerade auch im Rahmen unseres Wissens über die zugelassenen und nicht zugelassenen GVO.

Ein weiterer Ansatz besteht darin, PCR-basierte Quantifizierungsmethoden anzuwenden. Die PCR-basierte Quantifizierung kann sowohl während des Amplifikationsvorgangs (der Echtzeit-PCR) als auch an seinem Ende (end-point PCR) durchgeführt werden.

Der Analyse des Endprodukts liegt zwei Strategien zu Grunde: bei der einen wird ein Kompetitor (in geringer Menge) hinzufügt, um das Gemisch vor der PCR zu verstärken mit dem Ziel einer Quantifizierung. Dieser Prozess wird auch als „competitive quantitative PCR“ bezeichnet. Er basiert auf der Annahme, dass, wenn beide Ziel-DNAs und die competitive DNA die gleiche Menge an Amplifikationsprodukten ergeben, die Ausgangsmenge an DNA auch die gleiche sein dürfte.

Bei der Echtzeit-PCR-Analyse wird die Menge eines Produkts, die während der PCR synthetisiert wurde, direkt durch Messung der Fluoreszenz in einer PCR abgeschätzt. Es gibt im Handel erhältliche Hybridisierungssonden, bei denen die emittierte Fluoreszenz mit der Menge der synthetisierten DNA korreliert. Die Menge des synthetisierten Produkts kann auch durch das Ausstrahlen von interkaliertem Fluoreszenzfarbstoff geschätzt werden, aber hier ist es nicht möglich, zwischen den spezifischen und nicht-spezifischen Produkten zu unterscheiden. Der Vorteil dieses Verfahrens ist, dass nicht nur die Menge des gebildeten Produkts, sondern auch die definierte Anzahl von Zyklen im Ablauf verfolgt werden kann, die benötigt werden, um eine bestimmte Menge an PCR Produkt zu erzeugen. Die Echtzeit-PCR erfordert eine kompliziertere und teure Ausrüstung; sie ist jedoch schneller und spezifischer als die kompetitive PCR.

5.3.6. Der Detektionsprozess

Der Detektionsprozess ist ein Verfahren, das aus folgenden Einzelschritten besteht:

1. Die Probennahme. Die Beprobungsstrategie involviert komplexe Statistiken für eine zuverlässige Schätzung der erzeugten Menge von GVO oder deren Derivate.

2. Homogenisieren. Dieser Schritt umfasst die Homogenisierung der Probe.

3. Isolierung / Reinigung. Dieser Schritt betrifft die Isolierung und Reinigung einer DNA, RNA oder eines Proteins. Die kritischsten Faktoren bei diesem Schritt betreffen die Menge (Konzentration), die Reinheit und Qualität des Makromoleküls, das getestet werden soll. Auch hieran sind Statistiken beteiligt.

4. Vorhandenheitsanalyse. Bei diesem Schritt der Analyse wird eine Bestimmung des Vorhandenseins von GVO oder eines seiner Derivate durchgeführt. Wie oben bereits erwähnt, steht eine Reihe von alternativen Methoden zur Verfügung, die jeweils mit unterschiedlichen Fähigkeiten ausgestattet sind, zwischen Derivaten verschiedener GVO mit unterschiedlicher Zuverlässigkeit in Bezug auf die Ergebnisse „false (+)“ und „(-)“ zu diskriminieren. Weitere Überlegungen, die berücksichtigt werden sollten, betreffen die Frage, welches das Detektionsverfahren der Wahl sind: die Wahrscheinlichkeit, ob das Molekül vollständig abgebaut, das heißt nicht mehr detektierbar ist; die Wahrscheinlichkeit, ob während des „food processing“ das Molekül, wieder verloren gegangen ist; die Wahrscheinlichkeit, ob bei der Analyse im Falle einer Mischung von GVO der Identifikationsprozess komplizierter und zeitraubend ausfallen kann.

5. Identifizierung. Zur Identifizierung des detektierten Moleküls ist in der Regel jedes (+) Ergebnis wichtig, um falsche (+) Reaktionen zu vermeiden und die Identität des gefundenen Moleküls zu verifizieren.

6. Quantifizierung. Die quantitative Bestimmung des modifizierten Materials in einer Probe wird in diesem Schritt durchgeführt. Auch hier Statistiken sind wichtig, da die Quantifizierung immer die Beachtung von Standards erfordert.

7. Interpretation der Analyseergebnisse.

5.3.7. Vor- und Nachteile der Nachweisverfahren

Die Grenzen der Detektion und Quantifizierung können in drei Gruppen eingeteilt werden:

1. Absolute Grenzen - die niedrigste Zahl an Kopien, die am Anfang des ersten Zyklus stehen muss, damit die Detektion eine Wahrscheinlichkeit von 95%, hat;

2. Relative Grenzen - der niedrigste relative Anteil an gentechnisch veränderten Materialien, die nachgewiesen werden können;

3. Praktische Grenzen - die Grenzwerte für eine definierte Probe.

Die Spezifität der derzeit verfügbaren DANN-basierten Verfahren kann in vier Gruppen eingeteilt werden:

1. Screening Methoden, die eine breite Palette von GVO nachweisen, ohne diese selbst zu identifizieren;

2. Screening-Methoden für eine bestimmte Art der genetischen Veränderung;

3. spezifische Methoden, die manchmal zur Identifizierung von GVO verwendet werden;

4. Transformation spezifischer Methoden, die zur Identifizierung von GVO benutzt werden (noch im Entwicklungsstadium, nicht kommerzialisiert).