5.2.2. Методи за типизиране

Въз основа на молекулярно биологичните ДНК техники, са разработени разнообразни типизиращи методи за разграничаване на отделни видове, както и на изолати от даден вид. Данните, получени  от прилагането на тези методи, осигуряват ценна информация за разпространението и присъствието на микроорганизми, развалящи храните или за патогенни такива, не само в тях, но също така и в околната среда. По този начин ДНК-базирани методи могат да се използват за епидемиологични цели и  са полезни при разграничаването между едновременно случващите се, но независими инфекции, и епидемии, причинени от един единствен изолат. Този факт е от особена важност, тъй като може да облекчи прилагането на превантивни и хигиенни мерки.

Генотипните методи обикновено се категоризират в зависимост от техническите аспекти на прилагането им. В съответствие с този критерий могат да се изброят следните по-важни такива:

• ДНК секвениране;
• Анализ на рестрикционни ендонуклеазни профили на плазмидна и/илигеномна ДНК (напр. Полиморфизъм в Дължината на РестрикционнитеФрагменти (ПДРФ), Пулсова Гел Електрофореза (ПГЕ));
• Техники на основата на сонди (методи на белязане);
• Техники на основата на ПВР (амплификационни методи като СлучайноАмплифицирана Полиморфна ДНК (САПД) и Полиморфизъм вДължината на Амплифицираните Фрагменти (ПДАФ)).

Полиморфизъм в Дължината на Рестрикционните Фрагменти (ПДРФ). Този метод се основава на природната вариабилност на ДНК молекулите (хромозомна, плазмидна и митохондриална ДНК в еукариотите) по отношение на позицията и броя на 6- до 8-мерни последователности по дължината на тази молекула. Срязването на такава ДНК с рестрикционна ендонуклеаза води до образуване на фрагменти с различна дължина, които могат да се разделят с Агарозна Гел Електрофореза (AГE) и да се визуализират директно след оцветяване с етидиев бромид (в случай на ограничен брой фрагменти, например по-малко от 50) или след хибридизация със специфично белязана сонда.

Пулсовата Гел Електрофореза (ПГЕ) е техника, използвана за разделяне на големи ДНК молекули, като хромозоми. Тя може да се прилага също така и за разделяне на големи ДНК фрагменти, получени след срязване с т.н. рядко режещи рестрикционни ендонуклеази, които генерират ограничен брой фрагменти. Поради своята висока степен на полиморфизъм хромозомите/големите фрагменти ДНК са много полезни за видова идентификация.

Техники на основата на сонди (методи на белязане). Тези методи се отнасят до включване в/ или прикрепяне към края на дадена нуклеинова киселина на сонда. Съществуват различни варианти на основния метод в зависимост от разнообразни фактори. По отношение на типа нуклеинова киселина, нейния размер и количество могат да се изброят 4 метода на белязане: 3’ и 5’ крайно белязане, случайно белязане чрез ник-транслация и белязане със случайни праймери. По отношение на бележещата молекула, т.е. нейната природа, могат да се прилагат както радиоактивни, така и нерадиоактивни методи. При радиоактивното белязане се детектират радиоизотопи чрез авторадиография, докато нерадиоактивното белязане използва флуоресценция, хемолуминесценция или ензимни реакции.

Техники на основата на ПВР (амплификационни методи). При тези методи in vitro ензимно амплифициране на нуклеотидна последователност се използва за целите на видовата идентификация. Както основният метод на ПВР, така и неговите модификации служат като мощни средства за амплифициране на ДНК последователности от производствени щамове, щамове – замърсители и патогенни щамове, за тяхното детектиране и типизиране. Сред широкото разнообразие на ПВР-базирани методи, целящи директно идентифициране на даден организъм в хранителен продукт, най-често използваните методи са САПД и ПДАФ анализите.

Случайно Амплифицирана Полиморфна ДНК (САПД) е ПВР техника от т.н. случаен тип, основаваща на амплификация на ДНК регион, за който няма предварителна информация за каквато и да е последователност-мишена. Чрез аранжиране на 10-мерни праймери на случаен принцип и прилагане на амплификация при слаб контрол на амплификационните параметри, може да се получи набор от фрагменти (амплифицирани фрагменти), който по принцип е видово специфичен. Този факт допринася за приложението на САПД-ПВР като надежден метод за диференциране сред популации от микроорганизми.

Полиморфизъм в Дължината на Амплифицираните Фрагменти (ПДАФ). Това е високо чувствителен метод за детекция на полиморфизъм сред индивиди, приложим както за вътре- така и за междувидово разграничаване. Това е ПВР опосредстван ПДРФ на подбрани ДНК фрагменти сред широк набор такива. ПДАФ скринира за полиморфизъм в дължината на амплифицираните фрагменти чрез селективно амплифициране на някои от тях. Методът включва смилане на геномна ДНК с две рестрикционни ендонуклеази, последвано от ПВР амплификация на получените фрагменти. Рестрикционните фрагменти се модифицират предварително с адапторни последователности, специфични за използваните ендонуклеази, които по този начин служат като места за свързване с праймерите. Самите праймери са аранжирани по такъв начин, че позволяват силно специфична амплификация, поради факта, че само фрагменти, напълно съответстващи на последователностите на праймерите, се амплифицират.