5.2. Молекулни методи за контрол на генетично модифицираните храни

5.2.1. Методи за идентифициране на щамове микроорганизми

Таксономичният статус на микроорганизма-гостоприемник се счита за изключително важна характеристика по отношение на оценката на риска. Поради тази причина, микроорганизмите, които се използват за генетични манипулации, трябва да бъдат добре изучени таксономично чрез правилна  и точна методология. Те трябва да са адекватно охарактеризирани от научна, производствена и безопасна гледна точка. В момента, най-точното средство за правилно определяне на таксономичния статут на микроорганизмите са техниката на ДНК/ДНК хибридизация и дефиниране  на 16S рРНК секвенциите. Тези методи дават решаваща информация за таксономичния статут на изследваните микроорганизми. В момента на пазара съществува голямо ранообразие от стандартни физиологични/биохимични методи за фенотипна характеристика на микроорганизмите, които се използват широко. Важна характеристика в описанието на щама е  информацията за патогенните му свойства.

След приложението на процедурата за генетична модификация, полученият ГММ щам трябва да отговаря на особеностите определящи безопастността на микроорганизмите-гостоприемници. Новият щам трябва да се охарактеризира чрез същите методи и точност, включително фенотипни и генотипни характеристики. Това прецизно сравнение между гостоприемника и ГММ може да се осъществи чрез използването на съществуващи молекулни техники: рестрикционен анализ, Случайно Амплифицирана Полиморфна ДНК (САПД), Полиморфизъм в Дължината на Амплифицираните Фрагменти (ПДАФ), белтъчен профил и др. Анализът може да се разшири и към геномно секвениране.

Други важни фактори, които трябва да се изучат по отношение на оценката на риска на ГММ са:

- ефектът на генетичната модификация върху свойствата на микроорганизма-гостоприемник:

. стабилността на генетичната система и функционални особености на генния конструкт.

Всички тези характеристики са важни по време на процеса на оценка на безопасността на продуктите, получени от ГММ и тяхното влияние върху околната среда.

Методите за идентификация на щамове-продуценти, контаминирани щамове или патогени са техники, прилагани както на генотипно така и на фенотипно ниво. Генотипните методи включват техники като секвенционен анализ на рДНК, базов състав на ДНК и ДНК/ДНК хибридизация.

ДНК секвенирането, особено секвенционния анализ на рДНК има за цел сравнителен анализ на рДНК последователности. Това се осъществява чрез директно секвениране на части от или почти целия регион на 16S или 23S рДНК молекулата чрез полимеризационна верижна реакция (ПВР) с помощта на подходящи праймери.

Съотношението на ДНК базите (Г + Ц моларен %) е класически генотипен метод, част от стандартното описание на бактериалните таксони. Наблюдаваното вариране е не повече от 3 % в рамките на вида и не повече от 10% в рамките на даден род. Сред бактериите Г + Ц съдържанието варира между 24 и 76%.

ДНК/ДНК хибридизацията се прилага за идентификация на буквално всички бактерии, както и на широк набор от дрожди и гъби.

По отношение на таксономичната разделителна способност на тези методи, рДНК секвенционният анализ и определянето на базовия състав на ДНК са приложими за идентифициране на родове и видове, докато ДНК/ДНК хибридизационната техника се използва само за охарактеризиране до  ниво вид. Генотипните методи намират удачно приложение както при бактерии, така и при дрожди, и в известна по-ограничена степен при гъби (само рДНК секвенционния анализ).

Фенотипните молекулни методи включват снемане на ‘отпечатъци’ от клетъчните мастни киселини и електрофоретични профили на общ белтък. Тези методи се използват главно при идентификацията на бактерии и докато анализът на мастните киселини е приложим за идентифициране до ниво род и вид, електрофоретичният анализ се използва рутинно за видова идентификация.

5.2.2. Методи за типизиране

Въз основа на молекулярно биологичните ДНК техники, са разработени разнообразни типизиращи методи за разграничаване на отделни видове, както и на изолати от даден вид. Данните, получени  от прилагането на тези методи, осигуряват ценна информация за разпространението и присъствието на микроорганизми, развалящи храните или за патогенни такива, не само в тях, но също така и в околната среда. По този начин ДНК-базирани методи могат да се използват за епидемиологични цели и  са полезни при разграничаването между едновременно случващите се, но независими инфекции, и епидемии, причинени от един единствен изолат. Този факт е от особена важност, тъй като може да облекчи прилагането на превантивни и хигиенни мерки.

Генотипните методи обикновено се категоризират в зависимост от техническите аспекти на прилагането им. В съответствие с този критерий могат да се изброят следните по-важни такива:

• ДНК секвениране;
• Анализ на рестрикционни ендонуклеазни профили на плазмидна и/илигеномна ДНК (напр. Полиморфизъм в Дължината на РестрикционнитеФрагменти (ПДРФ), Пулсова Гел Електрофореза (ПГЕ));
• Техники на основата на сонди (методи на белязане);
• Техники на основата на ПВР (амплификационни методи като СлучайноАмплифицирана Полиморфна ДНК (САПД) и Полиморфизъм вДължината на Амплифицираните Фрагменти (ПДАФ)).

Полиморфизъм в Дължината на Рестрикционните Фрагменти (ПДРФ). Този метод се основава на природната вариабилност на ДНК молекулите (хромозомна, плазмидна и митохондриална ДНК в еукариотите) по отношение на позицията и броя на 6- до 8-мерни последователности по дължината на тази молекула. Срязването на такава ДНК с рестрикционна ендонуклеаза води до образуване на фрагменти с различна дължина, които могат да се разделят с Агарозна Гел Електрофореза (AГE) и да се визуализират директно след оцветяване с етидиев бромид (в случай на ограничен брой фрагменти, например по-малко от 50) или след хибридизация със специфично белязана сонда.

Пулсовата Гел Електрофореза (ПГЕ) е техника, използвана за разделяне на големи ДНК молекули, като хромозоми. Тя може да се прилага също така и за разделяне на големи ДНК фрагменти, получени след срязване с т.н. рядко режещи рестрикционни ендонуклеази, които генерират ограничен брой фрагменти. Поради своята висока степен на полиморфизъм хромозомите/големите фрагменти ДНК са много полезни за видова идентификация.

Техники на основата на сонди (методи на белязане). Тези методи се отнасят до включване в/ или прикрепяне към края на дадена нуклеинова киселина на сонда. Съществуват различни варианти на основния метод в зависимост от разнообразни фактори. По отношение на типа нуклеинова киселина, нейния размер и количество могат да се изброят 4 метода на белязане: 3’ и 5’ крайно белязане, случайно белязане чрез ник-транслация и белязане със случайни праймери. По отношение на бележещата молекула, т.е. нейната природа, могат да се прилагат както радиоактивни, така и нерадиоактивни методи. При радиоактивното белязане се детектират радиоизотопи чрез авторадиография, докато нерадиоактивното белязане използва флуоресценция, хемолуминесценция или ензимни реакции.

Техники на основата на ПВР (амплификационни методи). При тези методи in vitro ензимно амплифициране на нуклеотидна последователност се използва за целите на видовата идентификация. Както основният метод на ПВР, така и неговите модификации служат като мощни средства за амплифициране на ДНК последователности от производствени щамове, щамове – замърсители и патогенни щамове, за тяхното детектиране и типизиране. Сред широкото разнообразие на ПВР-базирани методи, целящи директно идентифициране на даден организъм в хранителен продукт, най-често използваните методи са САПД и ПДАФ анализите.

Случайно Амплифицирана Полиморфна ДНК (САПД) е ПВР техника от т.н. случаен тип, основаваща на амплификация на ДНК регион, за който няма предварителна информация за каквато и да е последователност-мишена. Чрез аранжиране на 10-мерни праймери на случаен принцип и прилагане на амплификация при слаб контрол на амплификационните параметри, може да се получи набор от фрагменти (амплифицирани фрагменти), който по принцип е видово специфичен. Този факт допринася за приложението на САПД-ПВР като надежден метод за диференциране сред популации от микроорганизми.

Полиморфизъм в Дължината на Амплифицираните Фрагменти (ПДАФ). Това е високо чувствителен метод за детекция на полиморфизъм сред индивиди, приложим както за вътре- така и за междувидово разграничаване. Това е ПВР опосредстван ПДРФ на подбрани ДНК фрагменти сред широк набор такива. ПДАФ скринира за полиморфизъм в дължината на амплифицираните фрагменти чрез селективно амплифициране на някои от тях. Методът включва смилане на геномна ДНК с две рестрикционни ендонуклеази, последвано от ПВР амплификация на получените фрагменти. Рестрикционните фрагменти се модифицират предварително с адапторни последователности, специфични за използваните ендонуклеази, които по този начин служат като места за свързване с праймерите. Самите праймери са аранжирани по такъв начин, че позволяват силно специфична амплификация, поради факта, че само фрагменти, напълно съответстващи на последователностите на праймерите, се амплифицират.

5.2.3. Методи за откриване и проследяване на щамове

Тук са приложими само генотипни методи, а именно всички техники на типизиране, изброени по-горе, с особен акцент върху ДНК белязането, чиято мощна разделителна способност дава възможност за детекция на ниво род, вид и щам при бактерии, дрожди и гъби.