5.3.5. DNA tabanlı yöntemler - PCR uygulaması

DNA tabanlı yöntemler, esas olarak spesifik bir DNA parçasının PCR tekniği ile çoğaltılmasına dayanmaktadır. Jel elektroforezi, çoğaltılmış ürünlerinin görüntülenmesi için rutin olarak kullanılmaktadır. Bu tek başına da gerçekleştirilebilir ya da restriksiyon endonükleaz kesimi (RFLP-PCR) ile birleştirilebilir. Temel PCR protokolünün daha sofistike bir varyantı, çift sarmallı DNA boya interkalasyonu vasıtasıyla ve floresan ışığı yayarak Tm profilinin belirlenmesini içermektedir. Sıcaklığın artmasıyla, DNA’nın İki ipliği ayrılmaya başlar ve buna bağlı olarak da ölçülebilir ışık emisyonu azalır. Tm, DNA uzunluğundan çok bir DNA dizisine özgü bir özelliktir. Son olarak da, bunun alternatifi, probları kullanmak ve DNA ya da RNA ile hibridizasyon gerçekleştirmektir. Bir prob, uygun tasarlanmış ise, doğal ve herhangi bir yabancı dizisi arasında ayrım yapabilir. Probu, radyoaktif ya da radyoaktif olmayan bileşiklerle etiketlemek, mevcut molekülün tespitini kolaylaştırmaktadır. GDO analizi için, jel elektroforezi ve hibridizasyon teknikleri şu anda en sık kullanılan tekniklerdir.

Temel PCR protokolü kullanılarak GDO'ların varlığı için gıda örneklerinin taranması, aşağıdaki prosedürden oluşmaktadır:

• Numunelerden alınan DNA ekstraktı ve bilinmeyen GDO içeriğinin standartları;
• Birkaç PCR’nin spesifik primerler ile birleşmesi (viral 35S CaMV ya da Tnos destekleyicileri gibi genellikle düzenleyici dizileri ile bilinen);
• DNA parçalarının, bir agaroz jel elektroforezi üzerinde görüntülenmesi;
• Görüntü analizi yazılımı kullanılarak analiz ve yarı-nicel analiz.

Multipleks PCR bazlı yöntemlerle birkaç DNA dizisi taranabilir ve tek bir reaksiyonda tespit edilebilir. Ancak, multipleks testin geliştirilmesi, dikkatli test etme ve onaylama gerektirir. Çeşitli amplikonları ayırt etmek için, amplifikasyon parçaları havuzunun, analiz edilmesi gerekmektedir. Bu, jel elektroforeziyle ve parça boyutunun karşılaştırılmasıyla özel hibridizasyon problarının yardımıyla ya da özel olarak etiketlenmiş primerler kullanılarak yapılabilir.

Bu tekniğin büyük bir avantajı, GDO’dan türetilmiş DNA’nın varlığına dair numuneyi test etmek için daha az reaksiyonun gerekli olmasıdır. Ayrıca, daha fazla miktar analizleri gerçekleştirmek gerekirse, prosedür nispeten pahalı olduğu için, hangi GDO’nun niceliğini belirleyeceğini bilirseniz iyi olur. Belirli bir GDO’nun tespiti, onaylanmış ve onaylanmamış GDO’lar hakkındaki bilgimiz bağlamında da önemlidir.

Diğer bir yaklaşım da PCR tabanlı miktar belirleme yöntemlerini uygulamaktır. PCR bazlı miktar belirleme, hem çoğaltma işlemi boyunca (gerçek zamanlı PCR) hem de işlem sonunda (son nokta PCR) gerçekleştirilebilir.

Son ürün analizleri, genellikle miktarı belirlenecek olan ve PCR'den önce amplifikasyon karışımına ilave edilen (bilinen az miktarda) ve miktarı belirlenecek hedef ile birlikte çoğaltılan bir rakip olmak üzere iki DNA hedefine ait amplifiye DNA birleşiminin karşılaştırılmasına dayanmaktadır: Bu sürece aynı zamanda rekabetçi nicel PCR denmektedir. Bu, hedef DNA ve rekabetçi DNA, aynı miktarda amplifikasyon ürünü verirse, DNA 'nın başlangıç miktarının da aynı olduğu varsayımına dayanmaktadır.

Gerçek zamanlı PCR analizinde, PCR sırasında sentezlenen bir ürünün miktarı, PCR’daki floresan ölçümü ile doğrudan tahmin edilir. Sentezlenen DNA miktarı ile ilgili floresan yayan, ticari olarak temin edilebilen melezleştirme probları bulunmaktadır. Sentezlenen ürünün miktarı, eklenen floresan boyanın yayılmasıyla da tahmin edilebilir ama burada özel olan ve özel olmayan ürünler arasında ayrım yapmak mümkün değildir. Bu yöntemin avantajı şudur: dinamiklerde, oluşturulan ürünün sadece miktarı takip edilmekle kalmaz, aynı zamanda, belirli bir miktar PCR ürünü oluşturmak için gerekli olan belirlenmiş döngü sayısı da tespit edilebilir.

Gerçek zamanlı PCR daha karmaşık ve pahalı ekipman gerektirmektedir; rekabetçi PCR’dan daha hızlı ve daha spesifiktir.