5.3. GDM’ların tespiti ve ölçülmesi için moleküler yöntemler

5.3.1. GDM tespiti

Sağlık ya da endüstriyel amaçlı kullanılacak ilk Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar (GDO) modifiye edilmiş suşlar olan Escherichia coli ve insülin üreten Saccharomyces cerevisiae’dir. Bu dönemden itibaren çok sayıda rekombinant mikroorganizma hayata geçirilmiştir. Sınırlandırıcı koşullar altında endüstriyel biyoreaktörlerde kullanılırlar ve bu tür işlemler, genellikle bir GDO tespit teknolojisi gerçekleştirilmesini gerektirmemektedir.

Böyle özel bir ihtiyacın sonucu, doksanların ortasında doğal ortamda genetiği değiştirilmiş (GD) hayvan ve bitkilerin girmesi ile ortaya çıktı.

GDO'lu ürünler, ağırlıklı olarak gıdalarda güvenlik değerlendirmesi ve çevrenin potansiyel değişikliği için, özellikle Batı Avrupa'da, önemli bir tartışma başlatmıştır. Tüketicilerin endişelerini gidermek için GDO bulundurmadığı garanti edilen gıdalar öne sürülmüştür. Ancak, gıda hazırlamada sadece hammaddeler değil, aynı zamanda, nihai ürünün içinde küçük miktarlarda bulunabilen, bitki kökenli çok sayıda katkı maddeleri de kullanılabilir. Bu, örneğin soya fasulyesinden elde edilen lesitin ile olan durumudur. Lesitin, çikolatalı hazırlıklarda kullanılan birçok endüstriyel tariflerde, çikolatalarda katkı maddesi olarak kullanılmaktadır. Analiz edilecek hedef, saflaştırılmış lesitinin kendisi (genetiği değiştirilmemiş soya fasulyesinden elde edilen lesitinle aynıdır) değildir, ancak değiştirilmiş bazı DNA dizileri ya da onlar tarafından kodlanmış olan rekombinant protein(ler)dir. İkinci bahsedilen, sadece eser (iz) miktarda bulunabilir, bu nedenle tespit edilmeleri için çok hassas yöntemler gereklidir.

5.3.2. Tespit yöntemlerinin çeşitleri

GDO ya da onun türevinin saptanması, özellikle genetik modifikasyon ya da ürünü ile bağlantılı olan (genetik değişim ile bağlantılı rekombinant protein) başlıca hedef (DNA dizisinin kendisi ve en sonunda da RNA) olan molekülünün tespit edilmesi ile gerçekleştirilebilir. Mevcut yöntemlerin büyük bir kısmı, DNA tespiti ile ilgilidir ve sadece birkaç teknik, RNA ve protein tespiti uygulanmaktadır. Bu durumun nedenleri şu şekildedir:

• DNA, PCR kullanılarak hızlı ve etkin bir şekilde çoğaltılabilir ve saflaştırılabilir. RNA ve proteinlerin çoğaltımı, daha karmaşık ve zaman alıcı bir süreçtir.
• RNA stabil değilken, DNA stabil bir moleküldür. Protein, gıda işleme sırasında kolayca sıcaklık denatürasyonuna tabi tutulur, böylece stabilitesi çeşitli dış faktörlere bağlıdır.
• Modifikasyon unsuru, nükleer DNA ise, onun miktarı ve GDO miktarının doğrusal bağımlılığı vardır. Ancak, bu tür bir ilişki, GDO miktarı ve RNA/Protein arasında nerdeyse hiç gözlenmez.
• Genetik modifikasyon, DNA düzeyinde yapıldığı için, bu değişimi aynı seviyede tespit etmek mantıklıdır.

Günümüzde, tüm ticari GDO’lar, yabancı nükleer DNA’ya sahiptir.

5.3.3. Protein bazlı yöntemler

Bu yöntemlerin temeli, immünolojiktir ve "antijen-antikor" türünü ve klasik ELISA analizinin spesifik bağlanmasında yatmaktadır. Antijen-antikor reaksiyonu, yabancı molekülü ayırt eder, buna bağlanır ve böylece de elde edilen bağlanmış kompleks, genellikle bir kromojenik reaksiyon ile tespit edilir. Antijeni tespit etmek için gereken antikor, saflaştırılmış antikorun kendisine ulaşmadan geliştirilemez, saflaştırılmış antikor, ya yapay olarak amino asit dizisinde sentezlenebilir ya da çalışılan GDO’dan saflaştırılır.

Genel olarak, bir transgenin ürünü, küçük bir polipeptid ya da herhangi bir dokuda ve bitkinin yaşam döngüsünün herhangi bir anında kuvvetli bir yapısal promotörün kontrolü altında ifade edilebilen bir proteindir. Bu şekilde, protein analitik bir hedef oluşturmak için yeterli miktarda bulunmaktadır. Ancak, daha yeni GD bitkilerde, istenen protein, sadece uyarılabilir bir promoterin kontrolü altında (örneğin, baskı altında, belirlenen yaşam süresi boyunca, vb.) üretilir. Bu durumda, rekombinant proteinin varlığının tespit ve analizi genellikle yeterli değildir.

5.3.4. RNA temelli yöntemler

Bu yöntemlerde, RNA molekülü ve bir primer (RNA ya da DNA sentetik oligonükleotid) arasındaki özel bağlanma gerçekleştirilir. RNA molekülünün başlangıcının tamamlayıcısı olan primer, onunla eşleşir ve bu da DNA’ya benzer bir çift sarmallı heterodubleks ile sonuçlanır. Ters transkriptaz kullanılarak bir DNA molekülü yeniden sentezlenebilir, bu da daha sonra PCR ile çoğaltılabilir ve tespit edilebilir. Bu yöntemin bir dezavantajı, özel primerlerin, tespit edilecek RNA bileşimi hakkında bilgi sahibi olmadan tasarlanamayacağı gerçeğidir.

5.3.5. DNA tabanlı yöntemler - PCR uygulaması

DNA tabanlı yöntemler, esas olarak spesifik bir DNA parçasının PCR tekniği ile çoğaltılmasına dayanmaktadır. Jel elektroforezi, çoğaltılmış ürünlerinin görüntülenmesi için rutin olarak kullanılmaktadır. Bu tek başına da gerçekleştirilebilir ya da restriksiyon endonükleaz kesimi (RFLP-PCR) ile birleştirilebilir. Temel PCR protokolünün daha sofistike bir varyantı, çift sarmallı DNA boya interkalasyonu vasıtasıyla ve floresan ışığı yayarak Tm profilinin belirlenmesini içermektedir. Sıcaklığın artmasıyla, DNA’nın İki ipliği ayrılmaya başlar ve buna bağlı olarak da ölçülebilir ışık emisyonu azalır. Tm, DNA uzunluğundan çok bir DNA dizisine özgü bir özelliktir. Son olarak da, bunun alternatifi, probları kullanmak ve DNA ya da RNA ile hibridizasyon gerçekleştirmektir. Bir prob, uygun tasarlanmış ise, doğal ve herhangi bir yabancı dizisi arasında ayrım yapabilir. Probu, radyoaktif ya da radyoaktif olmayan bileşiklerle etiketlemek, mevcut molekülün tespitini kolaylaştırmaktadır. GDO analizi için, jel elektroforezi ve hibridizasyon teknikleri şu anda en sık kullanılan tekniklerdir.

Temel PCR protokolü kullanılarak GDO'ların varlığı için gıda örneklerinin taranması, aşağıdaki prosedürden oluşmaktadır:

• Numunelerden alınan DNA ekstraktı ve bilinmeyen GDO içeriğinin standartları;
• Birkaç PCR’nin spesifik primerler ile birleşmesi (viral 35S CaMV ya da Tnos destekleyicileri gibi genellikle düzenleyici dizileri ile bilinen);
• DNA parçalarının, bir agaroz jel elektroforezi üzerinde görüntülenmesi;
• Görüntü analizi yazılımı kullanılarak analiz ve yarı-nicel analiz.

Multipleks PCR bazlı yöntemlerle birkaç DNA dizisi taranabilir ve tek bir reaksiyonda tespit edilebilir. Ancak, multipleks testin geliştirilmesi, dikkatli test etme ve onaylama gerektirir. Çeşitli amplikonları ayırt etmek için, amplifikasyon parçaları havuzunun, analiz edilmesi gerekmektedir. Bu, jel elektroforeziyle ve parça boyutunun karşılaştırılmasıyla özel hibridizasyon problarının yardımıyla ya da özel olarak etiketlenmiş primerler kullanılarak yapılabilir.

Bu tekniğin büyük bir avantajı, GDO’dan türetilmiş DNA’nın varlığına dair numuneyi test etmek için daha az reaksiyonun gerekli olmasıdır. Ayrıca, daha fazla miktar analizleri gerçekleştirmek gerekirse, prosedür nispeten pahalı olduğu için, hangi GDO’nun niceliğini belirleyeceğini bilirseniz iyi olur. Belirli bir GDO’nun tespiti, onaylanmış ve onaylanmamış GDO’lar hakkındaki bilgimiz bağlamında da önemlidir.

Diğer bir yaklaşım da PCR tabanlı miktar belirleme yöntemlerini uygulamaktır. PCR bazlı miktar belirleme, hem çoğaltma işlemi boyunca (gerçek zamanlı PCR) hem de işlem sonunda (son nokta PCR) gerçekleştirilebilir.

Son ürün analizleri, genellikle miktarı belirlenecek olan ve PCR'den önce amplifikasyon karışımına ilave edilen (bilinen az miktarda) ve miktarı belirlenecek hedef ile birlikte çoğaltılan bir rakip olmak üzere iki DNA hedefine ait amplifiye DNA birleşiminin karşılaştırılmasına dayanmaktadır: Bu sürece aynı zamanda rekabetçi nicel PCR denmektedir. Bu, hedef DNA ve rekabetçi DNA, aynı miktarda amplifikasyon ürünü verirse, DNA 'nın başlangıç miktarının da aynı olduğu varsayımına dayanmaktadır.

Gerçek zamanlı PCR analizinde, PCR sırasında sentezlenen bir ürünün miktarı, PCR’daki floresan ölçümü ile doğrudan tahmin edilir. Sentezlenen DNA miktarı ile ilgili floresan yayan, ticari olarak temin edilebilen melezleştirme probları bulunmaktadır. Sentezlenen ürünün miktarı, eklenen floresan boyanın yayılmasıyla da tahmin edilebilir ama burada özel olan ve özel olmayan ürünler arasında ayrım yapmak mümkün değildir. Bu yöntemin avantajı şudur: dinamiklerde, oluşturulan ürünün sadece miktarı takip edilmekle kalmaz, aynı zamanda, belirli bir miktar PCR ürünü oluşturmak için gerekli olan belirlenmiş döngü sayısı da tespit edilebilir.

Gerçek zamanlı PCR daha karmaşık ve pahalı ekipman gerektirmektedir; rekabetçi PCR’dan daha hızlı ve daha spesifiktir.

Tespit etme işlemi, aşağıdaki bireysel aşamalardan oluşan bir prosedürü içermektedir:

1. Örnekleme. Numune alma stratejisi, GDO ya da türevlerinin miktarına dair güvenilir bir şekilde tahmin yürütmek için karmaşık istatistikleri içerir.
2. Homojenizasyon. Bu aşama, numunenin homojenizasyonunu içerir.
3. İzolasyon/saflaştırma. Bu adım, bir DNA, RNA ya da proteinin izolasyonu ve saflaştırılması ile ilgilidir. Bu adımdaki en kritik faktörler, test edilecek makromoleküllerin miktarı (konsantrasyonu), saflığı ve kalitesidir. Burada yine istatistikler bulunmaktadır.
4. Mevcut olma/yokluk analizi. Bu aşamada, GDO’nun veya türevinin varlığının ya da yokluğunun belirlemesi için analizler gerçekleştirilir. Yukarıda da belirtildiği gibi, çeşitli alternatif yöntemler mevcuttur; bu yöntemlerin her birisi, farklı GDO türevleri arasında ayrım yapmak için farklı bir yetenek ve yanlış (+) ve (-) sonuçları ile ilgili farklı güvenilirlik sunmaktadır. Bir tespit yöntemi seçerken dikkate alınması gereken diğer önemli noktalar da şunlardır: Tespit edilecek olan molekülün tamamen bozulmuş olma olasılığı, yani artık tespit edilemez olması; gıda işleme sırasında tespit etme yönteminin saptamak için tasarlandığı molekülün, çıkarılmış olma olasılığı; bir GDO karışımı üzerinde gerçekleştirilecek olan analizin ve tanımlama işleminin daha karmaşık ve zaman alıcı olma olasılığı gibi konular dikkate alınmalıdır.
5. Tanımlama. Tespit edilen molekülün belirlenmesi amacıyla, yanlış (+) reaksiyonları çıkarmak ve bulunan molekülün kimliğini teyit etmek için genellikle herhangi bir (+) sonucun doğrulanması gerekmektedir.
6. Miktar belirleme. Modifiye edilmiş malzemenin nicel tahmini, bu aşamada gerçekleştirilir. Yine burada miktar belirleme, her zaman bazı standartları gerektirdiğinden istatistikler önemlidir.
7. Analiz sonuçlarının yorumlanması.

5.3.7. Tespit etme yöntemlerinin avantajları ve dezavantajları

Tespit etme ve miktar belirlemenin sınırları, üç gruba ayrılabilir:

1. Mutlak limitler - % 95 doğru tespit olasılığı elde etmek için ilk döngünün başında var olması gereken en düşük kopya sayısı;
2. Bağıl sınırları - tespit edilebilir genetiği değiştirilmiş malzemelerin en düşük nispi oranı;
3. Pratik sınırlar - tanımlı bir numune için geçerli sınırlar

Şu andaki mevcut DNA tabanlı yöntemlerin özgüllüğü, dört gruba ayrılabilir:

1. Geniş kapsamlı bir GDO’yu, onları tanımlamadan tespit eden tarama yöntemleri;
2. Belirli bir genetik modifikasyon türü için tarama yöntemleri;
3. GDO’ların tespiti için bazen kullanılan konstrakt özel yöntemler;
4. GDO’ların tespiti için kullanılan değişime özel yöntemler (hala laboratuvar geliştirme aşamasında; ticari amaçlı kullanılmamış).