5.1 Techniken für genetische Veränderungen

Die klassischen Methoden zur Genommodifikation von Mikroorganismen sind in zwei Typen unterteilt:

• Auswahl von Mutationen, die spontan und durch verschiedene physikalische und chemische Faktoren induziert in der Umwelt auftreten. Die spontanen Mutationen sind Folge der Umlagerungen innerhalb der vererbbaren DNA-Moleküle durch Substitution eines Nukleotids durch ein anderes, durch Addition oder Deletion eines oder mehrerer Nucleotide oder durch andere Arten von Änderungen. Eine erhebliche Menge an spontanen Mutanten entsteht durch die Bewegung eines Transposons an neue Orte innerhalb der Doppelstrang-DNA. Solche Vorgänge sind typisch für Pflanzen, Tiere und Mikroben.

• Austausch von DNA zwischen eng verwandten Organismen. Diese Art der Genveränderung in Mikroorganismen betrifft die Einführung neuer genetischer Information durch chromosomale oder Plasmid-DNA. Dieses Phänomen tritt auf, wenn die DNA aus dem Chromosom des Donor-Mikroorganismus in die DNA des Empfängers integriert wird. Selbstreplizierenden Plasmide übertragen die DNA des Donors auf die Empfänger auch ohne eine Integration in die chromosomale DNA. Somit kann Plasmid-DNA auf, im Vergleich zu den Spender, sehr unterschiedliche Organismen übertragen werden. Die Wanderung des Plasmids kann leicht mit Hilfe eines Markers (beispielsweise für Antibiotikaresistenz) beobachtet werden. Drei verschiedene klassische Arten von Gentransfer sind charakteristisch für Bakterien. Es wird angenommen, dass diese drei Mechanismen auch in der Natur vorkommen:

o DNA-vermittelte Transformation (die DNA wird als "nackte" DNA übertragen)

o Transduction – der Transfer von DNA wird durch ein Virus vermittelt

o Konjugation – die DNA wird während eines Zell-zu-Zell-Kontakts zwischen den Donor- und Empfängerzellen transferiert.

5.1.2. Molekulare Techniken

Neue molekulartechnologische Fortschritte bei der Mutagenese und Gentransferverfahren kommen haben das Spektrum von Mikroorganismen erheblich erweitert, in die DNA von nicht verwandten Organismen eingebracht werden kann. Die Gattungsbarriere gilt nicht mehr als unüberwindbares Hindernis.

Gegenwärtige Verfahren für Bakterien erlauben, das insertierte rekombinante Gen an spezifischen Stellen im Chromosom oder in Plasmide zu integrieren. Dennoch sollten auch diese Verfahren der Genveränderung Sicherheitserwägungen unterworfen werden. Folgende wichtige Merkmale stehen zur der Diskussion: Besonderheiten des Wirtsorganismus in Bezug auf insertierte Gene, Eigenschaften des Vektors und des Konstrukts; DNA-Transfer-Methoden.

Wenn Bakterien als Wirtsmikroorganismen verwendet werden, erfordert eine Sicherheitsbeurteilung, die Geschichte des sicheren Verbrauchs dieser Mikroorganismen entweder als Lebensmittel oder als Nahrungsmittelbestandteil zu berücksichtigen. Wenn dieser Nachweis fehlt, muss die Sicherheit des Wirts gewährleistet werden. Auf eukaryotische Wirte lassen sich die gleichen Sicherheitsaspekte anwenden.

Die inserierten Gene können von derselben mikrobiellen Spezies oder von evolutionär weiter entfernten Organismen stammen. Für die eingefügten Gen-Produkte sollte die Sicherheit ihrer Verwendung in Lebensmitteln begründet werden können. Je kürzer das insertierte DNA-Fragment, desto leichter kann das Verfahren zur Bewertung der Lebensmittelsicherheit ausfallen.

In Bezug auf die Eigenschaften des Vektors und des Konstrukts - wenn der verwendete Vektor ein Teil des Genoms des GMM, dann sollte die gesamte DNA-Sequenz gekennzeichnet werden: Replikons, Promoter, selektive Marker, Linker sowie alle anderen Teile der DNA. Der Vektor muss Nukleotidsequenzen von Mikroorganismen enthalten deren sichere Verwendung in Lebensmitteln bereits nachgewiesen worden ist. Die selektiven Marker müssen sehr streng ausgewählt und auf dem sicheren Einsatz beruhen, wobei antimikrobielle Resistenz-Marker vermieden werden müssen. Bei ihrer Verwendung sollten spezielle Verfahren zur Entfernung des GMM-Genoms benutzt werden (z. G. Sequenz-spezifische Rekombination). Bei für Eukaryoten spezifischen Klonierungsvektoren wie zentromerische Plasmide, ein künstliches Hefe-Chromosom, sollten die Plasmide auf Killerfaktoren enthalten, wie sie enthalten bereits entworfen worden sind.

In Hinblick auf DNA-Transferverfahren – es wird empfohlen, für die Verwendung Methoden des DNA-Transfers von physikalischer, chemischer und biologischen Natur einzusetzen, die bedeutsame genetische Umlagerungen im Wirtsgenom minimieren. Im Falle der Verwendung von integrativen Vektoren sollte die Nukleotidsequenz der flankierenden Regionen an der Integrationsstelle des Chromosoms charakterisiert werden. Diese Informationen sind notwendig, um das Risiko der angewandten Methoden vorhersagen zu können. Für Eukaryonten existieren schon zuverlässige Methoden zur gezielten Integration von in vitro modifizierten oder zusammengesetzten Gen-Konstrukten in spezifische chromosomale Bereiche sowie zum Löschen von Genen bei bestimmten Arten. Auf der Grundlage dieser Verfahren wurden transgene Konstrukte hergestellt, die sich während des vegetativen Wachstums von Zellen als sehr stabil erweisen. Die Möglichkeit einer Rekombination durch Paarung mit verwandten Stämmen besteht bezüglich der indigenen Mikroflora. Wenn die genetischen Eigenschaften der verwendeten Stämme nicht gut bekannt sind, machen es die unzureichenden Informationen über mögliche rekombinante Ereignisse unmöglich, den Mechanismus und Integrationsstelle der Fremdgene zu prognostizieren. Somit ist es möglich, die Methode der genetischen Manipulation von Hefen und filamentösen Pilzen so zu verwenden, dass die Integration das Auftreten von verschiedenen biotechnologischen Eigenschaften und die genetische Stabilität der GMMs bewirkt.

5.1.3. Vergleich der klassischen und molekularen Ansätze

Die Begriffe "klassisch" und "molekular" in Bezug auf die Methode der genetischen Veränderung von Mikroorganismen betrifft, wie es bereits erwähnt wurde, die Verbesserung ihrer genetischen Variabilität. Dieser Effekt wird mit klassischen Methoden durch eine spontane oder mutagen induzierte Variation, durch Hybridisierung oder Gentransfer erreicht. Diese Methoden sind aber ungenau und nicht gezielt und daher weniger leistungsfähig im Vergleich zu den molekularen Methoden für Genveränderungen. Aber es besteht kein Zweifel, dass es zwischen der genetischen Veränderung von Mikroorganismen durch klassische oder molekulare Techniken keine konzeptionelle Unterscheidung gibt, die DNA-Modifikationen oder einen Gentransfer verursachen.

Abb. 1 zeigt die genetische Veränderung von Mikroorganismen und den Pfad für die Einbringung in die Umwelt. Hier werden beide Methoden als Einheit dargestellt, sodass es keine Rolle spielt, ob klassische oder molekulare Züchtungsverfahren bei den verschiedenen Phasen der Bewertung einer Freisetzung im Labor-, Feld- oder in noch größerem Umweltmaßstab angewendet werden.

Abb. 1:

The underlying biological principles characterizing this concept were implicated in the EFSA reports:

• The primary focus for decision making about the introduction in the environment is the product obtained by genetic modification and selection, not the process itself.
• The characterization of the product needs information about the process used. But the nature of the process is not a sufficient criterion to decide whether the product should be more or less overseen.
• The responses of the microorganisms modified by molecular or classical methods are based on the same physical and biological laws. The accumulated knowledge about products of classical modifications could be applied on product obtained by application of molecular techniques in terms of relative safety and risk assessment.