5.3. Μοριακες μέθοδοι για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των ΓΤΜ

5.3.1. Η ανακάλυψη των ΓΤΜ

Οι πρώτοι γενετικώς τροποποιημένοι οργανισμοί (ΓΤΟ) με εφαρμογή για τους σκοπούς της υγειονομικής περίθαλψης και της βιομηχανίας είναι τροποποιημένα στελέχη Escherichia coli και Saccharomyces cerevisiae, που παράγουν την ινσουλίνη. Στη συνέχεια εφαρμόστηκαν πολυάριθμοι ανασυνδυασμένοι μικροοργανισμοί. Όλοι χρησιμοποιούνται σε βιομηχανικούς βιοαντιδραστήρες, υπό αυστηρά καθορισμένες συνθήκες και τέτοιες διαδικασίες συνήθως δεν απαιτούν την δεξαξωγή δοκιμών για την ανίχνευση των ΓΤΟ [10,12].

Η ανάγκη για τέτοιες ειδικές δοκιμές εμφανίστηκε με την εισαγωγή στα μέσα της δεκαετίας του ενενήντα του περασμένου αιώνα γενετικώς τροποποιημένων (ΓΤ) ζώων και φυτών στο περιβάλλον.

Κυρίως ΓΤ σιτηρά προκάλεσαν την έναρξη σημαντικών συζητήσεων, ιδιαίτερα στη Δυτική Ευρώπη, για την αξιολόγηση της ασφάλειας των τροφίμων και για ενδεχόμενη τροποποίηση του περιβάλλοντος. Για να ησυχία των καταναλωτών, εμφανίστηκαν ρόφιμα που επισημαίνονται ως προϊόντα χωρίς ΓΤΟ. Ωστόσο, δεν είναι μόνο η πρώτη ύλη που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την Παρασκευή τροφίμων, αλλά επίσης και ένα πλήθος από συστατικά φυτικής προέλευσης που μπορεί να υπάρχουν σε πολύ μικρές ποσότητες στο τελικό προϊόν. Αυτή είναι για παράδειγμα η περίπτωση της λεκιθίνης που εξάγεται από σόγια. Η λεκιθίνη χρησιμοποιείται ως πρόσθετο σε πολλές μονάδες βιομηχανικής παραγωγής σοκολάτας ή προϊόντων αρωματισμένων με σοκολάτας. Αυτό που πρέπει να αναλυθεί δεν είναι στην πραγματικότητα η καθαρισμένη λεκιθίνη (η οποία είναι πανομοιότυπη με τη μη τροποποιημένη λεκιθίνη από φυτά σόγιας), αλλά μόνο μερικές τροποποιημένες αλληλουχίες DNA ή οι κωδικοποιημένες από αυτές ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες. Οι τελευταίες μπορούν να υπάρχουν μόνο ως ίχνη. Αυτό απαιτεί τη χρήση πολύ ευαίσθητων μεθόδων για την ανίχνευσή τους.

Η ανίχνευση των ΓΤΟ ή παράγωγα αυτών μπορεί να επιτευχθεί με ανίχνευση του μορίου - ο πρωταρχικός στόχος (η ίδια η ακολουθία DNA και ενδεχομένως - RNA), ειδικά συνδεδεμένο με τη γενετική τροποποίηση του προϊόντος του (η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη η οποία μπορεί να παραχθεί σύμφωνα με τη γενετική τροποποίηση). Η πλειονότητα των υφιστάμενων μεθόδων αφορά την ανίχνευση DNA, και μόνο μερικοί εφαρμόζονται στην ανίχνευση του RNA και πρωτεϊνών. Οι λόγοι για το γεγονός αυτό είναι οι εξής:

• Το DNA μπορεί να ενισχυθεί και να καθαριστεί γρήγορα και αποτελεσματικά με την βοήθεια PCR. Η αναπαραγωγή του RNA και των πρωτεϊνών είναι πιο περίπλοκη και απαιτεί περισσότερο χρόνο.
• το DNA είναι ένα σταθερό μόριο, ενώ το RNA είναι ασταθές. Η πρωτεΐνη μπορεί εύκολα να υποβληθεί σε θερμική μετουσίωση κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας των τροφίμων, δηλαδή η σταθερότητά της εξαρτάται από πολλούς εξωτερικούς παράγοντες.
• Εάν το στοιχείο τροποποιήσεως είναι πυρηνικό DNA, υπάρχει μια γραμμική σχέση μεταξύ της ποσότητάς της και της ποσότητας των ΓΤΟ. Ωστόσο, τέτοια συσχέτιση δεν βρέθηκε μεταξύ της ποσότητας των ΓΤΟ και του RNA / των πρωτεϊνών.
• Δεδομένου ότι η γενετική τροποποίηση έχει πραγματοποιηθεί σε επίπεδο DNA, είναι λογικό η ανίχνευση αυτής της τροποποίησης να πραγματοποιείται στο ίδιο επίπεδο.

Επί του παρόντος, όλοι οι εμπορικοι ΓΤΟ έχουν ένα πυρηνικό DNA ξένου γένους.

5.3.3. Μέθοδοοι που βασίζονται σε πρωτεΐνη

Η βάση αυτών των μεθόδων είναι ανοσολογική και περιορίζεται σε ειδική σύνδεση του «αντιγόνου-αντισώματος» και κλασσική ανάλυση ELISA. Η αντίδραση αντιγόνο - αντίσωμα αναγνωρίζει το ξένο μόριο, συνδέεται με αυτό και το προκύπτον σύμπλοκο ανιχνεύεται συνήθως με χρωμογόνο αντίδραση. Επειδή το αντίσωμα που απαιτείται για την ανίχνευση του αντιγόνου δεν θα μπορούσε να αναπτυχθεί χωρίς πρόσβαση στο ίδιο το καθαρισμένο αντισώμα, αυτό θα πρέπει να συντεθεί τεχνητά σύμφωνα με μια γνωστή αλληλουχία αμινοξέος ή να καθαριστεί από τους ΓΤΟ που εξετάστηκαν.

Τυπικά, το διαγονιδιακό προϊόν είναι ένα μικρό πολυπεπτίδιο ή πρωτεΐνη η οποία μπορεί να εκφραστεί κάτω από τον έλεγχο ενός ισχυρού συστατικού προαγωγού σε κάθε ιστό, και πρακτικά σε οποιαδήποτε στιγμή του κύκλου ζωής του φυτού. Ως εκ τούτου, η πρωτεΐνη είναι σε επαρκή ποσότητα και αποτελεί έναν αναλυτικό στόχο. Ωστόσο, θα πρέπει να ληφθεί υπόψι ότι πρόσφατα στα τροποποιημένα φυτά η επιθυμητή πρωτεΐνη συντίθεται μόνο υπό τον έλεγχο ενός επαγόμενου υποκινητή (δηλαδή κάτω από συνθήκες στρες κατά τη διάρκεια ενός συγκεκριμένου σταδίου του κύκλου ζωής, κλπ.). Σε αυτήν την περίπτωση, η ανίχνευση και η ανάλυση για την παρουσία ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης είναι ανεπαρκείς.

5.3.4. Mέθοδοι που βασίζονται σε RNA

Σε αυτές τις μέθοδους διεξάγεται ειδική δέσμευση μεταξύ του μορίου RNA και του εκκινητή (συνθετικό RNA ή ολιγονουκλεοτίδιο DNA). Ο εκκινητής που είναι συμπληρωματικός προς το πρώτο μόριο RNA, συνδέεται με αυτό, διαμορφώνοντας ένα ετεροδιπλό διπλής αλυσίδας, παρόμοιο με το DNA. Χρησιμοποιώντας την αντίστροφη μεταγραφάση διεξάγεται de novo βιοσύνθεση του DNA, το οποίο μπορεί στη συνέχεια να ενισχύθεί με PCR και να ανιχνευθεί. Ένα μειονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι το γεγονός ότι οι ειδικοί εκκινητές μπορούν δεν μπορούν να κατασκευαστούν χωρίς γνώση της σύνθεσης του RNA που πρόκειται να ανιχνευθεί.

5.3.5. Μέθοδοι που βασίζονται σε DNA - ενίσχυση με PCR

Μέθοδοι που βασίζονται σε DNA, στηρίζονται στον πολλαπλασιασμό ενός συγκεκριμένου τμήματος του μορίου του DNA με την τεχνική PCR. Για την οπτικοποίηση των προϊόντων ενίσχυσης τυπικά χρησιμοποιείται ηλεκτροφόρηση πήγματος. Αυτή μπορεί να πραγματοποιηθεί ανεξάρτητα ή να συνδεθεί με άλεση ενδονουκλεάσης (RFLP-PCR). Μια πιο εξελιγμένη εκδοχή του βασικού πρωτόκολλου PCR περιλαμβάνει τον προσδιορισμό του προφίλ Tm μέσω της εισαγωγής βαφών στη διπλή αλυσίδα του DNA και εκπομπής φθορίζοντος φωτός. Με την αύξηση της θερμοκρασίας οι δύο αλυσίδες του DNA αρχίζουν να διαχωρίζουν και συνεπώς το εκπεμπόμενο φως που μπορεί να μετρηθεί είναι μειωμένο. Tm είναι πολύ πιο ειδικό χαρακτηριστικό των αλληλουχιών DNA σε σύγκριση με το μήκος του DNA. Μια άλλη επιλογή είναι η χρήση ανιχνευτών και η διεξαγωγή υβριδισμού με DNA ή RNA. Εάν κατασκευαστεί ένας κατάλληλος καθετήρας, αυτός θα μπορούσε να διαφοροποιήσει τη φυσικές από τις ξένες ακολουθίες. Η σήμανση του ανιχνευτή με ραδιενεργές ή μη ραδιενεργές ενώσεις μπορεί να διευκολύνει την ανίχνευση των μορίων. Επί του παρόντος, οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες τεχνικές για την ανάλυση των ΓΤΟ είναι η ηλεκτροφόρηση πηκτώματος και η υβριδοποίηση.

Η διαλογή δειγμάτων τροφίμων για την παρουσία ΓΤΟ, χρησιμοποιώντας το βασικό πρωτόκολλο της PCR περιλαμβάνει τις ακόλουθες διαδικασίες:

• Εξαγωγή του DNA από το δείγμα και πρότυπα με άγνωστη ποσότητα των ΓΤΟ,
• Διεξαγωγή αρκετών PCR με ειδικούς εκκινητές (συνήθως για πολύ καλά γνωστές ρυθμιστικές αλληλουχίες, όπως για παράδειγμα οι προαγωγοί 35SCaMV ή Tnos),
• Η οπτικοποίηση των θραυσμάτων του DNA σε ηλεκτροφόρηση πηκτώματος αγαρόζης,
• Ανάλυση και ημι-ποσοτική αξιολόγηση με τη χρήση λογισμικού απεικόνησης.

Με τη χρήση των μεθόδων που βασίζονται σε πολλαπλή PCR μπορούν να υποβληθούν σε διαλογή και να ανιχνευθούν πολλαπλές ακολουθίες DNA εντός μιάς μόνο αντίδρασης. Ωστόσο, η ανάπτυξη πολλαπλής ανάλυσης απαιτεί προσεκτική δοκιμή και επικύρωση. Τα διαθέσιμα θραύσματα ενίσχυσης θα πρέπει να αναλυθούν περαιτέρω για να διακριθούν τα μεμονωμένα προϊόντα ενίσχυσης. Αυτό μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας ειδικούς ανιχνευτές υβριδισμού σε ηλεκτροφόρηση πηκτώματος με τη σύγκριση των θραυσμάτων ως προς το μέγεθος, ή με τη χρήση επισημασμένων εκκινητών.

Ένα μεγάλο πλεονέκτημα αυτής της τεχνικής είναι το γεγονός ότι είναι αναγκαίος μικρότερος αριθμός αντιδράσεων για την εξέταση του δείγματος για την παρουσία DNA που προέρχεται από ΓΤΟ. Εάν είναι αναγκαία η διεξαγωγή πρόσθετης ποσοτικής ανάλυσης, θα ήταν καλό να γνωρίζουμε η ποσότητα ποιών ΓΤΟ θα παρακολουθείται, επειδή η διαδικασία είναι σχετικά ακριβή. Ο προσδιορισμός συγκεκριμένου ΓΤΟ είναι επίσης σημαντικός στο πλαίσιο της γνώσης μας για εγκεκριμένους και μη εγκεκριμένους ΓΤΟ.

Μια άλλη προσέγγιση είναι ο ποσοτικός προσδιορισμός, με βάση την PCR, ο οποίος μπορεί να πραγματοποιηθεί τόσο κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ενίσχυσης (η λεγομενη PCR σε πραγματικό χρόνο), και μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης (PCR σε τελικό σημείο).

Οι αναλύσεις του τελικού προϊόντος συχνά βασίζονται σε μια σύγκριση της ποσότητας του ενισχυμένου DNA από δύο στόχους DNA: ο ένας είναι εκείνος, η ποσότητα του οποίου πρόκειται να προσδιοριστεί, και ό άλλος είναι ο λεγόμενος «ανταγωνιστής» (σε μια μικρή αλλά γνωστή ποσότητα), ο οποίος προστίθεται στο μίγμα της ενίσχυσης πριν από την αντίδραση και συν-ενισχύεται με τον στόχο του οποίου η ποσότητα θα πρέπει να καθοριστεί. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται επίσης ανταγωνιστική ποσοτική PCR. Αυτή βασίζεται στην υπόθεση ότι αν και οι δύο DNA - ο στόχος και ο ανταγωνιστής - δίνουν την ίδια ποσότητα προϊόντος ενίσχυσης, τότε το αρχικό ποσό αυτών των μορίων DNA θεωρείται το ίδιο.

Στην ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο, το ποσό του συντεθέντος προϊόντος κατά τη διάρκεια της PCR προσδιορίζεται απευθείας μέσω μέτρησης του φθορισμού. Υπάρχουν διαθέσιμοι στο εμπόριο ανιχνευτές υβριδισμού που εκπέμπουν φθορισμό, που αντιστοιχεί στο ποσό του συντεθέντος DNA. Η ποσότητα του προϊόντος που συντίθεται μπορεί να προσδιοριστεί και από την εκπομπή μιας φθορίζουσα χρωστικής ουσίας, αλλά στην περίπτωση αυτή δεν είναι δυνατόν να γίνει διάκριση μεταξύ των ειδικών και των μη-ειδικών προϊόντων. Ένα πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι μπορεί να παρακολουθείται η ποσότητα των προϊόντων που σχηματίζονται σε εξέλιξη, και επίσης να καθοριστεί ο αριθμός των κύκλων που απαιτούνται για τη λήψη μιας συγκεκριμένης ποσότητας των προϊόντων PCR.

Η PCR σε πραγματικό χρόνο απαιτεί έναν πιο πολύπλοκο και ακριβό εξοπλισμό, αλλά είναι ταχύτερη και πιο συγκεκριμένη μέθοδος από την ανταγωνιστική PCR.

5.3.6. Η διαδικασία ανίχνευσης

Η διαδικασία ανίχνευσης είναι μια διαδικασία που αποτελείται από τα εξής επιμέρους βήματα:

1. Δειγματοληψία. Η στρατηγική για τη δειγματοληψία περιλαμβάνει πλήρη στατιστικά στοιχεία για να αποκτηθεί μια αξιόπιστη εκτίμηση της ποσότητας των ΓΤΟ και των παραγώγων τους.

2. Ομογενοποίηση. Αυτό το βήμα περιλαμβάνει την ομογενοποίηση του δείγματος.

3. Απομόνωση / καθαρισμός. Αυτό το βήμα σχετίζεται με την απομόνωση και τον καθαρισμό του DNA, RNA ή της πρωτεΐνης. Οι πιο κρίσιμοι παράγοντες για αυτό το βήμα είναι η ποσότητα (η συγκέντρωση), η καθαρότητα και η ποιότητα του μακρομορίου που μελετήθηκε. Εδώ, πάλι χρησιμοποιείται μια στατιστική ανάλυση.

4. Ανάλυση της παρουσίας / απουσίας. Σε αυτό το στάδιο διεξάγεται μια ανάλυση για την παρουσία ή όχι του ΓΤΟ ή των παράγωγών τους. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, ένα ευρύ φάσμα μεθόδων βρίσκεται στη διάθεση, καθεμιά από τις οποίες προσφέρει μία διαφορετική ανάλυση για τη διάκριση των παραγώγων των διαφόρων ΓΤΟ και διαφορετική αξιοπιστία σε σχέση με ψευδή (+) και (-) αποτελέσματα. Άλλες παράμετροι που θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την επιλογή της μεθόδου ανίχνευσης είναι: η δυνατότητα να είναι εντελώς υποβαθμισμένο το μόρια που πρέπει να ανισνευθεί, δηλαδή να μην μπορεί να προσδιοριστεί, η δυνατότητα να έχει αφαιαρεθεί κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας των τροφίμων, το μόριο που υποτίθεται ότι αποτελεί αντικείμενο της επιλεγείσας μέθοδου ανίχνευσης, η δυνατότητα να γίνεται η ανάλυση με ένα μείγμα από ΓΤΟ και αυτό θα οδηγήσει σε περίπλοκη και χρονοβόρα διαδικασία ταυτοποίησης.

5. Αναγνώριση. Για την ταυτοποίηση του μορίου στόχου συνήθως πρέπει να επιβεβαιωθούν όλα τα (+) αποτελέσματα προκειμένου να εξαλειφθούν οι ψευδείς (+) αντιδράσεις και να επιβεβαιωθεί η ταυτότητα του μορίου που βρέθηκε.

6. Ποσοτικοποίηση. Σε αυτό το στάδιο διεξάγεται ποσοτικοποίηση του τροποποιημένου υλικού σε ένα δείγμα. Εδώ πάλι, η στατιστική προσέγγιση είναι σημαντική επειδή οι ποσοτικοί προσδιορισμοί απαιτούν πάντα πρότυπα.

7. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων της ανάλυσης.

5.3.7. Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των μεθόδων ανίχνευσης

Τα όρια ανίχνευσης και ο ποσοτικός προσδιορισμός μπορούν να ταξινομηθούν σε τρεις ομάδες:

1. Απόλυτα όρια - ο μικρότερος αριθμός των αντιγράφων που πρέπει να είναι παρόντα κατά την έναρξη του πρώτου κύκλου προκειμένου να ληφθεί η σωστή ρύθμιση με πιθανότητα 95%,

2. Σχετικά όρια - το χαμηλότερο σχετικό ποσοστό γενετικώς τροποποιημένου υλικού, το οποίο μπορεί να προσδιοριστεί,

3. Πρακτικα όρια – τα όρια που εεφαρμόσιμα για ένα συγκεκριμένο δείγμα.

Η εξειδίκευση των διαθέσιμων προς το παρόν μεθόδων που βασίζονται επί του DNA, μπορεί να ταξινομηθεί σε τέσσερις ομάδες:

1. Μέθοδοι διαλογής που ανιχνεύουν ένα ευρύ φάσμα των ΓΤΟ χωρίς να τους προσδιορίζουν,

2. Μέθοδοι διαλογής για ένα συγκεκριμένο τύπο της γενετικής τροποποίησης,

3. Μέθοδοι που είναι ειδικες για ένα κατασκεύασμα, και χρησιμοποιούνται ενίοτε για την ταυτοποίηση των ΓΤΟ,

4. Οι μέθοδοι που βασίζονται σε συγκεκριμένο μετασχηματισμό και χρησιμοποιούνται για την ταυτοποίηση των ΓΤΟ (ακόμα στο στάδιο της εργαστηριακής ανάπτυξης, δεν είναι διαθέσιμα για εμπορικούς σκοπούς).