5.2. Genetiği değiştirilmiş gıdaların kontrolü için moleküler yöntemler

5.2.1. Suş belirleme yöntemleri

Konukçu mikroorganizmanın taksonomik durumu, güvenlik değerlendirmesinin öneminin bir özelliği olarak kabul edilmektedir. Bu nedenle, genetik manipülasyonlar için kullanılan mikroorganizmalar, uygun bir yöntem kullanılarak taksonomik olarak incelenmelidir. Bu, bilimsel, üretim ve güvenlik açısından yeterli bir şekilde karakterize edilmelidir. Şu anda, mikroorganizmaların taksonomik durumunun uygun karakterizasyonu için en kesin araç, DNA/DNA hibridizasyon tekniği ve 16S rRNA dizi tespitidir. Bu yöntemler, araştırma altındaki mikroorganizmaların taksonomik durumu hakkında önemli bilgiler vermektedir. Şu anda, fenotipik karakterizasyonu için standart biyokimyasal / fizyolojik yöntemler, piyasadadır ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Suş karakterizasyonu için önemli bir özellik de, patojenik özellikleri hakkındaki bilgidir.

Genetik modifikasyon işleminin uygulanmasından sonra, elde edilen GDM suşları, konukçu mikroorganizmaların güvenli özelliklerini sürdürmelidir. Yeni suş, güvenliğini değerlendirmek için fenotipik ve genotipik özellikler dâhil olmak üzere aynı yöntemler ve doğruluk ile karakterize edilmelidir. Konukçu ve GDM arasındaki doğru bir karşılaştırma; restriksiyon analizi, rastgele arttırılmış polimorfik DNA analizi (RAPD PCR), amplifiye parça uzunluk polimorfizmi (AFLP), protein profilleme gibi mevcut moleküler teknikler kullanılarak yapılabilir. Analiz, ayrıca genom sıralamasına genişletilebilir.

GDM güvenlik değerlendirmesi açısından incelenmesi gereken diğer önemli faktörler de şunlardır: genetik modifikasyonun, konukçu mikroorganizmanın özellikleri, genetik sistemin stabilitesi, gen yapısının işlevsel özellikleri üzerine etkisi.

Tüm bu özellikler, GDM’lar tarafından elde edilen ürünlerin ve çevre üzerindeki etkilerinin güvenlik değerlendirmesi sürecinde önemlidir.

Üretim suşları, kirletici suşları ya da patojenleri tanımlama yöntemleri, genotip ve fenotip düzeyde uygulanan tekniklerden oluşmaktadır. Genotip yöntemler, rDNA dizileme analizi, DNA baz kompozisyonu ve DNA/DNA hibridizasyon gibi araçları içermektedir.

DNA dizileme, özellikle rDNA dizileme analizi, rDNA dizilerinin karşılaştırmalı çalışmalarını amaçlamaktadır. Bu, uygun primerler kullanılarak PCR ile parçaları ya da hemen hemen tüm 16S veya 23S rDNA molekülünü doğrudan dizileme yoluyla gerçekleştirilir.

DNA baz oranı (mol yüzdesi G + C), bakteri taksonlarının standart tanımının bir parçası olan klasik bir genotipleme yöntemidir. Gözlenen aralık, tür içinde en fazla % 3 ve bir familya içinde en fazla% 10'dur. Bakteriler arasında G + C içeriği, % 24 ve 76 arasında değişmektedir.

DNA/DNA hibridizasyonu, hem çok çeşitli mayalar ve mantarların, hem de hemen hemen tüm bakterilerin belirlenmesi için uygulanmaktadır.

Bu yöntemlerin taksonomik çözünürlüğü ile ilgili olarak DNA/DNA hibridizasyonu, sadece türlerin karakterizasyonu için kullanılırken, rDNA dizileme analizi ve DNA baz kompozisyonu, familya ve türlerin tanımlanması için kolayca uygulanmaktadır. Genotipleme yöntemlerinin, bakteri ve mayalar için ve küçük ölçüde de mantarlar (sadece rDNA dizileme analizi) için yararlı uygulamaları bulunmaktadır.

Fenotipleme moleküler yöntemler, hücresel yağ asitleri parmak izi ve toplam hücresel protein elektroforetik desenleri içermektedir. Bu yöntemler özellikle bakteri tanımlamada kullanılmaktadır ve ilki familya ve türlerin seviyesi için geçerliyken, ikincisi rutin olarak türlerin tanımlaması için kullanılmaktadır.

5.2.2.Tipleme yöntemleri

Moleküler biyoloji tekniklerinin tanıtılmasıyla türleri ve ayrıca belli bir türün izolatlarını birbirinden ayırt etmek için DNA tabanlı tipleme yöntemleri, tasarlanmıştır. Bu yöntemleri uygulayarak elde edilen veriler, sadece çevrede değil aynı zamanda gıdalardaki besin bozucu mikroorganizmaların ya da patojenik olanların yaygınlaştırılması ve sürerliği hakkında bilgi sağlayabilir. Bu nedenle, DNA tabanlı tipleme yöntemleri, epidemiyolojik amaçlı kullanılabilir ve tek bir izolattan kaynaklanan çakışık fakat bağımsız enfeksiyonları ve salgın hastalıkları ayırt etmeye yardımcı olabilir. Bu, koruyucu ve hijyenik tedbirlerin uygulanışını kolaylaştırabildiği için özel bir önem taşımaktadır.

Genotipleme yöntemleri genellikle teknik yönlere dayanarak kategorize edilmektedir. Buna göre, aşağıdakiler listelenebilir:

• DNA dizileme;
• Plazmid ve/veya genomik DNA’nın endonükleaz desen analizini kısıtlama (örneğin Kısıtlama Parçası Uzunluk Polimorfizmi (RFLP), Pulse Field (Darbeli alan) Jel Elektroforezi (PFGE));
• Prob-tabanlı teknikler (etiketleme yöntemleri);
• PCR temelli teknikler (örneğin, Rastgele arttırılmış polimorf DNA (RAPD) ve Arttırılmış parça uzunluk polimorfizmi (AFLP) gibi amplifiye yöntemleri).

Kısıtlama Parçası Uzunluk Polimorfizmi (RFLP), bu molekül boyunca 6- ve 8- mer dizisinin konumu ve sayısı ile ilgili DNA moleküllerinin (kromozomlar, plazmidler ve ökaryotlardaki mitokondrial DNA) doğal değişkenliği araştırmaktadır. Böyle bir DNA’yı restriksiyon endonükleazı ile kesme, Agaroz Jel Elektroforezi (AGE) ile ayrılabilen ve etidyum bromid ile boyamadan hemen sonra (sınırlı sayıda parçanın, olması durumunda, örneğin 50’den az) ya da etiketlenmiş belirli problar ile hibridizasyondan (melezleme) sonra görülebilen farklı uzunluktaki parçaların üretimiyle sonuçlanır.

Pulse-Field Jel elektroforezi (PFGE), kromozomlar gibi büyük DNA moleküllerinin ayrılmasında başvurulan bir tekniktir. Bu, sınırlı sayıda parça üreten nadir kesme restriksiyon endonükleazlarıyla kesim sonrası elde edilen büyük DNA parçalarının ayrılması için de uygulanabilir. Son derece polimorfik olan kromozomlar/büyük parça desenleri, suş tanımlanması için çok yararlıdır.

Prob tabanlı yöntemler (etiketleme yöntemleri). Bu yöntemler, bir nükleik asit parçasının içine ya da sonuna prob ekleme ile ilgilidir. Temel yöntemin farklı varyasyonları, çeşitli faktörlere bağlı olarak bulunmaktadır. Nükleik asit türü, büyüklüğü ve miktarıyla ilgili olarak 3 've 5' uç etiketleme, çentik translasyonu ile rastgele etiketleme ve rastgele birincil etiketleme olmak üzere 4 etiketleme yöntemi sıralanabilir. Etiketleme molekülü hususunda, yani doğasıyla ilgili, radyoaktif ve radyoaktif olmayan etiketlemeler keşfedilebilir. Radyoaktif olmayan etiketleme floresan, kemo-luminesans ya da enzimatik reaksiyonları kullanırken, radyoaktif etiketlemede ise radyoizotoplar, otoradyografi ile tespit edilmektedir.

PCR tabanlı teknikler (amplifikasyon yöntemleri). Bu yöntemlerde, nükleotid dizisinin in vitro enzimatik amplifikasyonu, suş tanımlama amacıyla incelenmektedir. Temel PCR protokolü ve modifikasyonları, bir DNA’nın ilgi dizisinin, saptama ve üretim tiplemenin, kirletici ve patojenik suşların çoğaltılması için güçlü araçlardır. Bir gıda ürününde bulunan bir organizmanın doğrudan tanımlanmasını hedefleyen PCR tabanlı yöntemlerin geniş çeşitliliği içinde, RAPD ve AFLP analizleri, en yaygın olarak kullanılanlardır.

Rastgele arttırılmış polimorf DNA (RAPD), bir hedef sekans ile ilgili öncesinde herhangi bir bilgi olmaksızın bir DNA bölgesinin çoğaltılmasına dayalı rastgele bir tip PCR yöntemidir. Rastgele 10-mer primerlerin tasarlanması ve düşük kesinlikte kontrol amplifikasyon koşullarının uygulanmasıyla genel olarak tek özgün bir dizi amplifiye dizisi elde edilebilir. Bu son durum, RAPD-PCR’nin, mikroorganizma populasyonları arasındaki farkı ortaya koymak için güvenilir bir yöntem olarak kullanımına katkıda bulunmaktadır.

Amplified (Çoğaltılmış) Parça Uzunluk Polimorfizmi (AFLP), türler arası ve tür içi ayrım için uygulanabilen, bireyler arasındaki polimorfizm tespiti için son derece hassas bir yöntemdir. Bu, bir havuzdan seçilmiş DNA parçalarının PCR geçişli RFLP’idir. AFLP, bazı parçaların seçici amplifikasyon (çoğaltılması) ile arttırılmış parçaların uzunluğunda polimorfizm için inceleme yapar. Yöntem, elde edilen parçalarının PCR amplifikasyonunu takiben genomik DNA’nın 2 restriksiyon endonükleazı ile sindirimini içerir. Restriksiyon parçaları, deneyde kullanılan endonükleazlara özel adaptörlerle (çoğaltılmanın) amplifikasyonunun öncesinde modifiye edilir ve böylece primer bağlanma yerleri olarak görev yapar. Sadece primerler sekansı ile tam olarak eşleşen parçaların amplifiye edilecek olması nedeniyle, primerlerin kendisi adaptörlere bağlanacak ve çok özel bir amplifikasyon (çoğaltma) sağlayacak şekilde tasarlanırlar.

5.2.3 Suş tespit ve izleme yöntemleri

Burada, sadece genotipleme yöntemleri, yani ayırt etme etkisinin; bakteriler, mayalar ve mantarlarda familya, tür ve suş düzeyinde tespitini kapsayan DNA probları üzerinde durularak yukarıda listelenmiş olan tüm tipleme teknikleri incelenmiştir.