5.1. Genetik değiştirme teknikleri

5.1.1. Klasik yöntemler

Mikroorganizmaların genom modifikasyonu için klasik yöntemler iki tipe ayrılır:

• Kendiliğinden ortaya çıkan ve çevredeki farklı fiziksel ve kimyasal faktörlerin neden olduğu mutasyonların seçimi. Kendiliğinden olan mutasyonlar, bir nükleotidin diğerinin yerine konması, bir veya daha fazla nükleotidin eklenmesi ya da çıkarılması ya da diğer yeniden oluşum tipleri nedeniyle kalıtsal DNA molekülündeki düzenlenmelerin sonucudur. Çift iplikli DNA'da hareketli (transpozıbıl) elementlerin yeni yerlere doğru hareketi nedeniyle bir sürü kendiliğinden olan mutantlar ortaya çıkmaktadır. Bu tür elementler; bitkiler, hayvanlar ve mikroplar için tipiktir.
• Yakından ilişkili organizmalar arasında DNA değişimi. Mikroorganizmalarda bu tip bir gen modifikasyonu, kromozomal ya da plazmid DNA aracılığı ile yeni genetik bilgi girişini ilgilendirmektedir. Bu olay, donör mikroorganizmanın kromozomundan alınan DNA’nın alıcı mikroorganizmanın DNA’sına entegre edildiği zaman gerçekleşmektedir. Kendi kendine çoğalan plazmidler, donörün DNA’sını, alıcının kromozomal DNA ile entegre edilmeden alıcıya transfer etmektedir. Bu nedenle, plazmit DNA, donör olanlara kıyasla çok farklı organizmalara aktarılabilmektedir. Kendi molekülünde bulunan belirleyiciler (örneğin antibiyotik direnci) sayesinde plazmidin hareketi kolayca gözlenebilmektedir. Gen transferinin üç farklı klasik tipi, bakterilerin ayırt edici özelliğidir. Bu üç mekanizmanın doğal olarak oluştuğu düşünülmektedir:
• DNA aracılı transformasyon (DNA, "çıplak" DNA olarak aktarılmaktadır).
• Transdüksiyon - DNA transferine bir virüs aracılık etmektedir.
• Konjugasyon – DNA, donör ve alıcı hücreler arasında hücre-hücre teması sırasında aktarılmaktadır.

5.1.2. Moleküler teknikler

Mutagenez ve gen aktarım yöntemlerindeki son moleküler teknolojik gelişmeler, oldukça ilgisiz organizmalardan gelen DNA’nın sokulabildiği mikroorganizma yelpazesini ciddi derecede genişletmiştir. Tür bariyeri ve alem bariyeri artık aşılmaz engeller değildir.

Bakterilerde kullanılan mevcut yöntemler, eklenen gen rekombinant yapıların, belirli bölgelerden kromozom ya da plazmide entegre edilmesini sağlar. Bununla birlikte, gen değiştirme süreçleri, güvenlik değerlendirmelerine tabi tutulmalıdır. Şu önemli özellikler, bir tartışma konusudur: eklenen gen(ler) açısından konakçı mikroorganizmanın kendine has özelikleri, vektör ve konstrağın özellikleri; DNA transferi yöntemleri.

Bakteriler, konukçu mikroorganizmalar olarak kullanıldığı zaman, güvenlik değerlendirmesi prosedürü, bir yiyecek ya da bir gıda bileşeni olarak bu mikroorganizmanın güvenli tüketim geçmişini gerektirmektedir. Bu kanıt yok ise, konağın güvenliği sağlanmalıdır. Ökaryotik konakçı için, aynı güvenlik değerlendirmeleri uygulanmaktadır.

Eklenen gen(ler), aynı mikrobik türden ya da evrimsel olarak daha uzak bir organizmadan alınabilir. Eklenen gen ürünlerinin, gıdada güvenli kullanım öyküsü olmalıdır ya da güvenliği ispat edilmelidir. Eklenen DNA parçası ne kadar kısa olursa, gıda güvenliği değerlendirilme prosedürü o kadar azaltılmış/ kolaylaştırılmış olacaktır.

Vektör ve yapının özellikleri ile ilgili olarak - kullanılan vektör, GDM genomunun bir parçası ise, replikonlar, promotör, seçici belirleyiciler, bağlayıcılar ve DNA'nın herhangi bir başka parçası dâhil olmak üzere tüm DNA dizisi karakterize edilmelidir. Vektör, gıdada güvenli kullanım geçmişi olan mikroorganizmalardan nükleotid dizisi içermelidir. Seçici belirleyiciler, çok titizlikle ve güvenli kullanıma dayalı olarak seçilmeli ve antimikrobiyal direnç belirleyicilerden kaçınılmalıdır. Kullanım durumunda, GDM genomundan uzaklaştırılması için özel yöntemlerin uygulanmalıdır (örn, diziye özgü rekombinasyon). Ökaryotlar için, sentromer plazmidler, maya yapay kromozomu, öldürücü faktör belirleyicilerine dayalı plazmidler gibi belirli klonlama vektörleri tasarlanmıştır.

DNA transferi yöntemlerinden bahsetmişken - konukçu genomda başlıca genetik düzenlemeleri en aza indiren fiziksel, kimyasal ve biyolojik doğanın DNA transferi yöntemlerini kullanmak için öneriler bulunmaktadır. Bütünleştirici vektörlerin kullanılması durumunda, kromozomun entegrasyon alanında yan bölgelerin nükleotid dizileri, karakterize edilmelidir. Bu bilgiler, kullanılan yöntemlerin riskini tahmin etmek için gereklidir.

Ökaryotlarda, in vitro değiştirilmiş ya da oluşturulmuş gen yapılarının, spesifik kromozomal bölgelere yöneltilmiş entegrasyonu için ve bazı türlerde uygulanabilen genlerin silinmesi için güvenilir yöntemler vardır.

Bu yöntemlere dayanarak, transgenik yapılar oluşturulmuştur ve bu yapılar, hücrelerin bitkisel büyüme dönemlerinde oldukça istikrarlıdır. Yerel mikrofloranın ilgili suşları ile eşleştirme yoluyla rekombinasyon olasılığı bulunmaktadır. Kullanılan suşların genetik özellikleri iyi bilinmediği zaman, olası rekombinant olaylarıyla ilgili yetersiz bilgi, yabancı genlerin mekanizmasını ve entegrasyon bölgesini öngörmeyi imkansız kılar. Bu nedenle, maya ve filamentli mantarların genetik manipülasyonunda kullanılan yöntemin, çeşitli bölgelerde entegrasyon sağlaması mümkündür, bu da GDM’ların biyoteknolojik özelliklerinde ve genetik dengesinde farklılıkların oluşmasına neden olabilir.

5.1.3. Klasik ve moleküler yaklaşımların karşılaştırılması

Mikroorganizmaların genetik modifikasyon metodolojisi ile ilgili "klasik" ve "moleküler" terimleri, zaten belirtildiği gibi, genetik değişkenliğin artırılması ile ilgilidir. Bu etki, spontan veya mutajenle başlatılmış değişim, hibridizasyon ya da gen transferi ile klasik yöntemler kullanılarak elde edilmektedir. Bu yöntemler, gen değişiklikleri için moleküler yöntemlerle karşılaştırıldığında doğru değildir ve herhangi bir şeye yönelik değildir ve daha az etkilidir. Ama DNA değişiklikleri ve gen transferine neden olan klasik ya da moleküler tekniklerle mikroorganizmaların genetik modifikasyonları arasında kavramsal olarak hiçbir ayrım olmadığına hiç şüphe yoktur.

Şekil 1, mikroorganizmaların genetik modifikasyonunu ve çevreye girmeleri için yolları göstermektedir. Burada; laboratuvarda, alanda ya da büyük ölçekli ortam girişlerinde değerlendirme aşamalarında klasik ya da moleküler ıslah yöntemlerinin uygulanıp uygulanmaması noktasında her iki yöntem de bütünleşmiştir.

Şekil 1:

Bu kavramı karakterize eden temel biyolojik ilkeler, 'Saha Testi Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar: Karar Çerçevesi (1989)' raporunda açıklanmıştır:

• Ortama girmesi konusunda karar vermek için birincil odak noktası, sürecin kendisi ile değil, genetik modifikasyon ve seçim ile elde edilen üründür.
• Ürünün nitelendirilmesinde, kullanılan süreçle ilgili bilgiye ihtiyaç duyulmaktadır. Ama sürecin doğası, ürünün az ya da çok denetlenip denetlenmemesine karar vermek için yeterli bir kriter değildir.
• Moleküler ya da klasik yöntemlerle değiştirilmiş mikroorganizmaların tepkileri, aynı fiziksel ve biyolojik yasalara dayanmaktadır. Klasik değişikliklerin ürünleri hakkındaki bilgi birikimi; göreceli güvenlik ve risk değerlendirmesi açısından moleküler tekniklerin uygulanması ile elde edilen bir ürün üzerinde uygulanabilir.